黑血3D DANTE-CUBE磁共振管壁成像技術(shù)

對動脈粥樣硬化血管重復(fù)掃描的實驗研究

常 樂 陳錄廣 彭雯佳 李 帥 陳士躍 陸建平

隨著磁共振成像技術(shù)的發(fā)展，各類高分辨黑血磁共振血管壁成像技術(shù)（magnetic resonance vessel wall imaging，MR-VWI）層出不窮[1-2]，實現(xiàn)了對動脈管壁的直接可視化評估，能夠定性和定量評價動脈粥樣硬化斑塊成分及斑塊穩(wěn)定性等特征[3]。延遲交替進動的定制激發(fā)技術(shù)（delay alternating with nutation for tailored excitation，DANTE）早期用于高分辨磁工作波譜實驗，進行選擇性的激發(fā)窄帶寬的頻率區(qū)域。隨后該技術(shù)在磁共振成像中飽和組織信號進行一維或二維的空間標(biāo)記，它能夠抑制流動自旋質(zhì)子的信號，同時能最大程度地保留靜止自旋質(zhì)子的信號[4]。本研究運用3D DANTE-CUBE管壁成像序列對新西蘭大白兔的腹主動脈管壁進行可重復(fù)性分析，探討該MR-VWI技術(shù)在動物實驗中定性和定量評價的穩(wěn)定性和可靠性。

方 法

1.實驗動物

選用8只健康的成年新西蘭大白兔作為實驗對象，雄性和雌性各4只，平均體質(zhì)量為3.03±0.78kg，由海軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供并負責(zé)飼養(yǎng)?；A(chǔ)飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后隨機分為兩組，實驗組5只，后續(xù)對其腹主動脈制作動脈粥樣硬化模型；對照組3只，始終基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)。

2.實驗組造模

實驗組5只兔先行高脂飼料（基礎(chǔ)飼料79.5%，豬油5%，蛋黃粉15%，膽固醇0.5%）喂養(yǎng)4周，自由飲水。然后采用內(nèi)膜拉傷法制作腹主動脈的斑塊模型，術(shù)前禁食12小時，術(shù)中利用異氟烷氣體麻醉機（MSS-3S，上海任誼生物科技有限公司），麻醉濃度1.5%，流量計濃度0.5L/min，兔仰臥體位，腹股溝區(qū)脫毛消毒后切約3cm開口，確認股動脈后采用Seldinger技術(shù)穿刺插入導(dǎo)絲導(dǎo)管。將4F球囊擴張導(dǎo)管插入至腹主動脈約心臟下方水平2cm左右，球囊內(nèi)緩慢充入生理鹽水，感覺有阻力后緩慢拉出，反復(fù)3次。去除球囊，壓迫止血后，傷口處撒少許青霉素粉末，縫合切口。術(shù)后肌注青霉素3天，預(yù)防感染。造模后繼續(xù)高脂飼料喂養(yǎng)12周，而后行MRI檢查。

3.MRI掃描

運 用 3.0T MRI掃 描 儀（Discovery MR750，GE Healthcare， Milwaukee），32通道腹部線圈覆蓋軀干，俯臥位、尾先進，檢查全程氣體麻醉，第一次掃描（圖1）2周后重復(fù)掃描一次（圖2）。成像目標(biāo)血管是腹主動脈，掃描序列包括：3D DANTE CUBE T1WI，冠狀位掃描，掃描范圍上至膈肌下至腹股溝下緣， TR/TE=1100.0/12.9ms，層厚1.2mm，層間距 0.6mm，層數(shù) 92，F(xiàn)OV=200×200mm2，采集矩陣=256×256，采集時間8min22s；3D DANTE CUBE T2WI序列，冠狀位掃描， 掃描范圍上至膈肌下至腹股溝下緣 ， TR/TE=2000.0/58.6ms，層 厚 1.2mm， 層 間 距 0.6mm， 層 數(shù) 84，F(xiàn)OV=200mm×200mm，采集矩陣=256×256，采集時間351秒。

4.圖像測量

首先，針對第一次MRI掃描圖像，“觀察者1”（影像醫(yī)學(xué)科副主任醫(yī)師，從事心血管疾病影像學(xué)研究9年）定量測量一次，之后針對第二次MRI掃描圖像，“觀察者1”測量一次，以計算兩次掃描的一致性；同時，針對第二次掃描，“觀察者2”（影像醫(yī)學(xué)科醫(yī)師，從事心血管疾病影像學(xué)研究3年）測量一次，以計算觀察者間的一致性；間隔2周后，針對第二次掃描，“觀察者1” 再測量一次，以計算觀察者內(nèi)的一致性。具體測量方法（圖3、4）：利用RadiAnt DICOM Viewer 4.2.1（Medixant， Poland）軟件導(dǎo)入所有掃描序列，依次對冠狀位掃描的DANTE預(yù)脈沖3D CUBE T1WI和T2WI序列進行橫軸位重建，最后在重建的圖像中進行定量評價，有斑塊的血管以斑塊最厚處為中心選取上下連續(xù)的6個層面測量，無明顯斑塊的血管則以右腎動脈開口下緣為起始向下選取連續(xù)的6個層面測量，測量參數(shù)包括腹主動脈的管腔面積（AL）、血管總面積（AT），計算管壁面積（AW）：AW=AL- AT。

5.病理檢查

完成磁共振檢查后將實驗動物處死（10%KCl溶液1ml/kg耳緣靜脈注射），解剖分離出主動脈，按相應(yīng)解剖標(biāo)志截取掃描范圍內(nèi)的腹主動脈，經(jīng)生理鹽水沖洗干凈血凝塊，將標(biāo)本固定于10%中性福爾馬林溶液，脫鈣、整體包埋于石蠟中，連續(xù)切片（間距1mm，層厚10μm），從近心端開始依次編號，行HE染色。

6.統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0和Medcalc 13.0統(tǒng)計軟件進行分析。采用Kolmogorov-Smirnov方法對計量資料正態(tài)性檢驗，符合正態(tài)分布資料用（）表示。采用配對樣本t檢驗比較兩次掃描、觀察者內(nèi)和觀察者間重復(fù)測量的差異性。統(tǒng)計組內(nèi)相關(guān)系數(shù)（intraclass correlation coefficient，ICC）和變異系數(shù)（coefficient of variability，CV）評估一致性，ICC＞0.75表示一致性非常好，ICC在0.4～0.75之間表示一致性較好，ICC＜0.4表示一致性較差；CV＜15%表示一致性非常好。

結(jié) 果

實驗組的1只新西蘭大白兔在造模手術(shù)后死亡，1只兔在完成第一次磁共振掃描后死亡，最終實驗組剩余3只兔和對照組3只兔完成所有實驗項目并納入統(tǒng)計分析。3D DANTE-CUBE序列可以清晰顯示兔的腹主動脈管壁情況，3只實驗組兔的腹主動脈局部可見管壁不均勻增厚、甚至偏心弧形斑塊形成。定量測量相同水平范圍的腹主動脈橫軸位管壁面積，在DANTE-CUBE T1WI上測量的實驗組管壁面積明顯大于對照組（0.5195±0.1815 vs. 0.2863±0.3337，P＜0.001）， 在 DANTE-CUBE T2WI測量的實驗組管壁面積也顯著大于對照組（0.4671±0.1546 vs. 0.3030±0.0346，P＜0.001）。病理檢查發(fā)現(xiàn)3只實驗組的腹主動脈管壁內(nèi)膜均不同程度偏心性增厚，厚薄不均的纖維斑塊形成（圖5），未見大的脂質(zhì)核、斑塊內(nèi)出血或鈣化等復(fù)雜成分。

所有完成實驗的6只兔的重復(fù)掃描的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI測量的AL的一致性非常好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT（ICC＞0.4，CV=17.51%）和 AW 的一致性較好（ICC＞0.75，CV=16.87%）； 在 DANTE-CUBE T2WI測 量的 AL和 AW的 一 致 性 都 非 常 好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT的 一 致 性 較 好（ICC＞0.75，CV=17.65%）（表1）。觀察者內(nèi)的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI測量的所有血管壁參數(shù)的一致性都非常好（ICC＞0.75，CV＜15%）；在DANTE-CUBE T2WI測量的AL和AW的一致性非常好（ICC＞0.75，CV＜15%），AT的一致性較好（ICC＞0.4，CV＜15%）（表2）。觀察者間的一致性分析：在DANTE-CUBE T1WI和T2WI測量的所有血管壁參數(shù)的一致性都非常好（ICC＞0.75，CV＜15%）（表3）。

圖1 模型組新西蘭大白兔腹主動脈第一次掃描的3D DANTE-CUBE圖像。A. DANTE-CUBE T2WI序列，白箭指示腹主動脈偏心斑塊，虛白箭指示右腎動脈近端；B. DANTE-CUBE T1WI序列。圖2 模型組新西蘭大白兔腹主動脈第二次掃描的3D DANTE-CUBE圖像，與圖1為同一只兔。A. DANTE-CUBE T2WI序列；B. DANTE-CUBE T1WI序列，白箭指示腹主動脈偏心斑塊。

圖3 模型組新西蘭大白兔腹主動脈3D DANTE-CUBE T2WI的重建及管壁參數(shù)測量。A. 冠狀位掃描的DANTECUBE T2WI圖像局部放大圖，黃線指示腹主動脈斑塊水平；B. DANTE-CUBE T2WI的橫軸位重建圖（A圖黃線水平），白箭指示腹主動脈右側(cè)壁偏心弧形斑塊，斑塊在T2WI上呈明顯高信號（與肌肉信號相比）；C. 在DANTECUBE T2WI的橫軸位重建圖上測量管壁參數(shù)，勾畫血管壁輪廓（綠圈）、軟件自動測算出血管總面積（AT）為0.3868cm2，勾畫血管腔輪廓（紅圈）得到管腔面積（AL）為0.06535cm2。圖4 模型組新西蘭大白兔腹主動脈3D DANTE-CUBE T1WI的重建及管壁參數(shù)測量，與圖3為同一只兔。A. 冠狀位掃描的DANTE-CUBE T1WI圖像局部放大圖，黃線指示腹主動脈斑塊水平；B. DANTE-CUBE T1WI的橫軸位重建圖（A圖黃線水平），白箭指示腹主動脈右側(cè)壁偏心弧形斑塊，斑塊在T1WI上呈等信號（與肌肉信號相比），結(jié)合圖3表現(xiàn)（斑塊在T2WI呈高信號），提示斑塊成分主要為纖維化組織；C. 在DANTE-CUBE T1WI的橫軸位重建圖上測量管壁參數(shù)，勾畫血管壁輪廓（紅圈）、軟件自動測算出血管總面積（AT）為0.3297cm2，勾畫血管腔輪廓（綠圈）得到管腔面積（AL）為0.05519cm2。

圖5 模型組新西蘭大白兔腹主動脈的HE染色。A. 腹主動脈橫切面全景圖（×50），管腔內(nèi)膜側(cè)偏心性增厚（黑箭）；B. 為A的局部放大圖（×200），可見血管內(nèi)膜明顯增厚（黑箭），主要是纖維化組織，包括膠原蛋白和平滑肌細胞，內(nèi)膜深層的肌彈力層亦增厚。

表1 兔腹主動脈3D DANTE-CUBE MRI重復(fù)掃描一致性

表2 兔腹主動脈3D DANTE-CUBE MRI觀察者內(nèi)的一致性

表3 兔腹主動脈3D DANTE-CUBE MRI觀察者間的一致性

討 論

本實驗利用高脂飼料加動脈內(nèi)膜損傷法制作新西蘭大白兔的腹主動脈粥樣硬化模型，該模型技術(shù)相對成熟、造模效果確切，常用于對特定血管的動脈粥樣硬化模型制作的動物實驗中[5]，但相較于單純高脂喂養(yǎng)的缺點是動物死亡率較高，筆者團隊在實踐中發(fā)現(xiàn)球囊拉傷術(shù)中要求操作者的手感輕柔、力度適中，術(shù)后預(yù)防性使用抗生素、在飼料中適量補充維生素粉劑可一定程度降低手術(shù)并發(fā)癥。另外，本實驗運用MRI兼容的動物專用氣體麻醉機，氣體麻醉的主要優(yōu)點是麻醉效果好、麻醉持續(xù)時間容易掌握、動物蘇醒快、不良反應(yīng)較少，保障了在造模手術(shù)和MRI檢查過程中的麻醉效果和動物安全。

DANTE序列是近來興起的一種MR-VWI的黑血（血流信號抑制）技術(shù)[4，6]，它采用多個小角度非選擇性激發(fā)脈沖與梯度脈沖作為運動敏感的磁化預(yù)準備，能夠抑制流動自旋質(zhì)子信號，其優(yōu)點包括：能夠抑制任何方向的血流信號；能夠?qū)崿F(xiàn)2D或3D MRVWI；脈沖鏈的射頻激發(fā)角度較小，射頻能量少，可行多層MRI；對射頻場B1的不均勻性不敏感。另外，三維成像也是未來MR-VWI發(fā)展的趨勢，與2D相比3D掃描有諸多優(yōu)勢，比如能夠?qū)崿F(xiàn)各項同性的空間分辨率（0.5～0.8mm3），具有較大的層方向上的成像覆蓋范圍，具有較高的信噪比與成像效率，可行任意方向的重建，且重建圖像仍具有較高的空間分辨率。目前，主流的3D技術(shù)為可變翻轉(zhuǎn)角快速自旋回波序列，不同MRI儀生產(chǎn)產(chǎn)商有不同的命名（通用醫(yī)療為CUBE，西門子醫(yī)療為SPACE，飛利浦醫(yī)療為VISTA），其原理與2D快速自旋回波成像技術(shù)類似，不同之處在于在層方向上施加相位編碼梯度場用于層面選擇，并且重聚焦脈沖采用了可變的射頻翻轉(zhuǎn)角?；诳勺兎D(zhuǎn)角技術(shù)實現(xiàn)了各向同性的數(shù)據(jù)采集和提高成像時間效率，同時小角度射頻脈沖降低了射頻能量沉積。但是當(dāng)遇到緩慢血流或復(fù)雜血流（如湍流）時，3D可變翻轉(zhuǎn)角快速自旋回波序列常常信號抑制不充分，導(dǎo)致“假斑塊”偽影，因此聯(lián)合黑血技術(shù)使用可以克服這一缺點，本研究正是采用了聯(lián)合3D大范圍高效高分辨成像（3D CUBE序列）和血流抑制（DANTE預(yù)脈沖）的成像方法，而且掃描方向采用冠狀位，實現(xiàn)在Z軸（主動脈走行方向）上盡量覆蓋較大范圍，提高了成像效率。

本研究驗證了基于DANTE血流抑制的3D CUBE管壁成像序列能夠定性和定量區(qū)分動脈粥樣硬化管壁和正常動脈管壁，清晰顯示管壁增厚和斑塊形成，并且定量分析重復(fù)掃描對管壁評價的一致性較好，在同一個評價者不同時間定量測量的一致性也很好，在不同資歷影像醫(yī)師定量分析的一致性非常理想，說明本研究采用的高分辨3D DANTE-CUBE管壁成像序列在動物實驗中表現(xiàn)非常穩(wěn)定，將來需要轉(zhuǎn)化應(yīng)用于人的頭頸部動脈粥樣硬化斑塊的評價和驗證。在評價斑塊成分方面，根據(jù)動脈粥樣硬化斑塊的MRVWI和病理研究結(jié)果[7-11]，多對比序列管壁成像可以準確判斷斑塊內(nèi)的主要成分，通常選擇同序列的肌肉組織信號作為比較標(biāo)準，纖維化組織T1WI上呈等/低信號、T2WI上呈高信號，脂質(zhì)核T1WI上呈等/高信號、T2WI上呈低信號，鈣化T1WI上和T2WI均呈低信號，斑塊內(nèi)出血在早期（1周內(nèi)）和近期（1～6周）T1WI上呈明顯高信號、T2WI早期為等/低信號、近期也呈明顯高信號，斑塊內(nèi)出血在慢性期（超過6周）T1WI和T2WI上均呈低信號。本研究的病理證實3只實驗組新西蘭大白兔的腹主動脈形成的斑塊均為纖維化斑塊，其信號均為T1等信號、T2高信號，符合纖維化組織成分的信號表現(xiàn)。

綜上所述，本研究采用的3D DANTE-CUBE序列對動物的動脈管壁可以清晰顯示和定量評價，可以精準定位增厚的管壁和動脈粥樣硬化斑塊，并且重復(fù)掃描、組內(nèi)及組間的可重復(fù)性都達到良好水平，為將來的臨床應(yīng)用奠定了實驗和技術(shù)基礎(chǔ)。