正常宮頸、CIN、宮頸鱗癌中P-gp、MRP1、Survivin的相關表達及對新輔助化療作用的研究

陳 芬 彭瑞宇 孟 佳 張麗萍

1 昆明愛維艾夫醫(yī)院，云南省昆明市 650000； 2 華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬武漢兒童醫(yī)院(武漢市婦幼保健院)；3 湖北醫(yī)藥學院附屬太和醫(yī)院

宮頸癌是全球范圍排名第4位的常見惡性腫瘤，也是女性面臨的主要健康問題[1]，嚴重影響患者的生活質量。其中，子宮頸癌類型中以鱗狀細胞癌最為常見，占 75%～80%，其次為腺癌，其他病理類型的宮頸癌較為少見[2]。宮頸癌的傳統(tǒng)治療方法是根治性手術和放化療，ⅠA期～ⅡA期宮頸癌患者的治療方式以手術治療為主，其優(yōu)點是年輕患者可以選擇性地保留卵巢和陰道的部分功能；ⅡB期及以上患者以放療為主；晚期和復發(fā)轉移的患者，主要采取化學療法。宮頸癌新輔助化療(Neoadjuvant chemotherapy，NACT)是近年才興起的宮頸癌治療方案。由Frei[3]在1982年首先提出新輔助化療的概念，即對于臨床表現為巨塊型或局部晚期的患者，在手術前或放療前先使用化療，以利于局部治療手段的實行?；熾m然可以提高治療效果，可是由化療產生的耐藥性是導致化療失敗的關鍵原因之一。在實施新輔助化療方案時，需提前考慮化療對于該患者是否有效。P-gp、MRP1、Survivin是與耐藥相關的三種基因蛋白，本研究通過聯(lián)合檢測三者在正常宮頸、CIN以及宮頸鱗癌新輔助化療前后的表達，探討其在新輔助化療中的作用，進而為采取有效的治療方案提供相關的依據，以便更好地指導臨床用藥。

1 材料與方法

1.1 標本來源和相關臨床資料 收集我院2016年2月—2017年3月間相關標本，經本院病理科活檢確診為：正常宮頸組織15例，CIN組織15例(無特殊疾病)，以及宮頸癌患者的標本，其中符合在本院行新輔助化療前均未行任何化療、放療和免疫治療的初治患者，及新輔助化療后行手術切除的石蠟配對標本共30例。所有患者的病理切片均由資深病理科專家復閱宮頸癌HE病理切片并再次確診。采用國際婦產科聯(lián)盟(FIGO，2009)[4]臨床分期標準：宮頸癌Ⅰb2期10例，Ⅱa期20例，總共30例。且均符合：初治患者(未接受過化療、放療和免疫治療)；患者年齡26～64歲，平均年齡為46.24歲；癌灶直徑≥4cm；血WBC≥4×109/L，PLT≥10×109/L；心肺肝腎及凝血功能均無異常；無其他惡性腫瘤病史。所選病例均行開普拓(CPT-Ⅱ)聯(lián)合順鉑(DDP)靜脈滴注的化療方案，具體用法[5]：CPT-Ⅱ60mg/m2,化療第1、8、15天靜脈滴注；DDP 60mg/m2,僅第1天靜脈滴注，并常規(guī)水化。每個療程間隔時間28d。化療1個療程后觀察患者的近期臨床療效。化療總療程結束后14d，各項生化指標恢復接近正常水平時，行廣泛全子宮切除及盆腔淋巴結清掃術，并留取組織石蠟封存。

1.2 NACT臨床療效判定 化療結束后2周，根據婦檢、婦科陰道B超來測量宮頸癌灶的大小變化，以此判斷其行新輔助化療后的近期臨床療效。根據國際抗癌協(xié)會(UICC)療效判定標準：完全緩解(Complete remission，CR)：可見的腫瘤病變完全消失，維持4周以上；部分緩解(Partial remission，PR)：腫瘤病灶的最大直徑及其最大的垂直橫徑的乘積縮小>50%以上，其他病灶無增大，無新病灶出現，維持4周以上；穩(wěn)定(Stable disease，SD)或無變化(No change，NC)：腫瘤病灶的兩徑乘積縮小不足50%，或增大不超過25%，無新病灶出現，維持4周以上；進展(Progressive disease，PD)：腫瘤病灶的兩徑乘積增大25%以上或出現新病灶。臨床有效=CR+PR；臨床無效=SD+PD。

1.3 實驗方法和主要試劑 采用免疫組化S-P法(采用生物素標記的第二抗體，使之與鏈霉菌抗生物素蛋白連接的過氧化物酶及基質色素混合，并利用此混合液來測定細胞和組織中的抗原成分)及自動圖像分析系統(tǒng)來檢測。經載破片、組織切片、微波抗原修復等步驟獲取石蠟切片。P-gp、MRP1單克隆抗體及Survivin多克隆抗體及SP試劑盒均購于福建邁新生物科技有限公司。分別用PBS緩沖液代替3種一抗作為陰性對照，并用已知的陽性病理切片作為陽性對照片。運用Image Pro Plus 6.0自動圖像分析系統(tǒng),于×200倍鏡下，隨機選取5個視野,系統(tǒng)自動隨機測定每個視野3個不同的部位,最后提取陽性細胞,測定平均光密度值(OD) 。

1.4 免疫組化結果的相關判定 P-gp、MRP1陽性染色顆粒位于胞膜和(或)胞漿中，Survivin陽性染色顆粒定位于細胞漿。陽性結果為胞膜和(或)胞漿中出現淡黃至棕黃色顆粒為陽性。陽性信號運用Image Pro Plus 6.0自動圖像分析系統(tǒng),于×200倍鏡下，隨機選取5個視野,系統(tǒng)自動隨機測定每個視野3個不同的部位,最后提取陽性細胞,測定平均光密度值(OD) 。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件對數據進行統(tǒng)計學分析，采用t檢驗、χ2檢驗及單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 正常宮頸組織、CIN及化療前宮頸鱗癌中P-gp、MRP1、Survivin的表達 P-gp、MRP1、Survivin從正常宮頸組織到CIN再到宮頸鱗癌，三者陽性表達量是顯著升高的，且在宮頸鱗癌組織中表達最高,具體見表1。

表1 P-gp、MRP1、Survivin在正常宮頸組織、CIN和宮頸鱗癌中的表達

注：P<0.01，差異有顯著的統(tǒng)計學意義。

2.2 P-gp、MRP1、Survivin在宮頸鱗癌新輔助化療前后的表達 新輔助化療前、后P-gp、Survivin的OD值比較差異有統(tǒng)計學意義，MRP1化療前后差異無統(tǒng)計學意義,具體見表2及圖1～6。

表2 P-gp、MRP1、Survivin在宮頸鱗癌新輔助化療前后的表達

2.3 P-gp、MRP1、Survivin的表達與新輔助化療近期臨床療效之間的關系 P-gp在新輔助化療有效組中的表達量顯著低于無效組中的表達量(P<0.01)；MRP1在新輔助化療有效組中的表達量與無效組中的表達量無差別(P>0.05)；Survivin在新輔助化療有效組中的表達量顯著低于無效組中的表達量(P<0.01)，具體見表3。

表3 P-gp、MRP1、Survivin 在NACT化療后的表達與近期臨床療效之間的關系

圖1 P-gp在宮頸鱗癌化療前的陽性表達S-P×200

圖2 P-gp在宮頸鱗癌化療后的陽性表達S-P×200

圖3 MRP1宮頸鱗癌化療前陽性表達S-P×200

圖4 MRP1宮頸鱗癌化療后陽性表達S-P×200

圖5 Survivin宮頸鱗癌化療前陽性表達S-P×200

圖6 Survivin宮頸鱗癌化療后陽性表達S-P×200

3 討論

目前宮頸癌的主要治療方法是手術和放療，但其臨床預后效果并不理想，隨著新輔助化療的廣泛應用，其化療療效也越來越明顯[6]。新輔助化療可以縮小腫瘤病灶，降低癌細胞的宮旁浸潤程度，使部分喪失手術機會的患者再次獲得手術機會，同時也可以增強其對放療的敏感性。化療雖然可以提高治療效果，可是由化療產生的耐藥性是導致化療失敗的關鍵原因之一。對于化療不敏感的患者實施新輔助化療，可能導致病情進一步加重，從而延誤最佳治療時機。因此，由于耐藥導致的化療失敗在很大程度上限制了新輔助化療藥物的選擇和使用。

P-糖蛋白是一種能量依賴性且具有跨膜外排泵作用的糖蛋白。是多藥耐藥基因 MDR-1的編碼產物，經ATP水解供能將藥物主動轉運出胞外，最終導致腫瘤耐藥[7]。應瑜等在對50例Ⅰb2-Ⅱb期宮頸癌患者的研究中表明化療后P-gp在宮頸鱗癌陽性表達率顯著升高，由化療前56%上升到85%(P<0.05)，且在 P-gp陽性表達的患者中化療有效率為39.29%，陰性表達的患者中化療有效率高達100.00%[8]。本研究發(fā)現P-gp在正常宮頸組織、CIN及宮頸鱗癌中均有不同程度的表達，且正常宮頸組織

多藥耐藥相關蛋白MRP是一種跨膜轉運糖蛋白，介導腫瘤細胞的多藥耐藥，目前已發(fā)現9個成員，其中MRP1與腫瘤細胞的多藥耐藥關系最為密切[9]。其機制可能是隨著化療療程的延長腫瘤細胞內MRP1基因過度表達或腫瘤細胞本身存在過度表達的MRP1基因，導致化療藥物被泵出細胞外，從而產生腫瘤耐藥[10]。本研究發(fā)現MRPl在正常宮頸組織、CIN及新輔助化療前宮頸鱗癌組織中均有不同程度的表達，MRPl在新輔助化療前的宮頸鱗癌組織中的表達>CIN>正常宮頸組織(P<0.01)。MRPl在正常組織中的表達，考慮與機體的自身保護機制有關，為正常生理功能的體現。本研究還發(fā)現，MRPl在初治宮頸鱗癌組織中表達高，說明宮頸鱗癌也是MRPl的高表達腫瘤，可能存在MRPl介導的原發(fā)性耐藥。本研究中宮頸鱗癌患者新輔助化療后，MRPl的陽性表達量雖然有升高，但是新輔助化療并沒有明顯促進MRPl的表達(P>0.05)。進一步說明，化療后MRPl的高表達，并不是由于新輔助化療藥物誘導所致。因此我們認為，多藥耐藥相關蛋白1(MRPl)可能僅介導宮頸鱗癌的原發(fā)性耐藥，不參與繼發(fā)性耐藥。

Survivin是迄今發(fā)現的最強的凋亡抑制因子，是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，在腫瘤細胞增殖、凋亡以及血管形成過程中發(fā)揮重要作用[11]。且Survivin在組織中的表達具有很明顯的特點，其在正常組織無表達或低表達，在大多數終末分化組織中缺失或低表達，而在大多數人實質性腫瘤和血液惡性腫瘤中強表達，與腫瘤的發(fā)病、浸潤及預后密切相關[12-13]。Wall等[14]研究證實，Survivin Thr34磷酸化對維持細胞分裂、保持細胞活性是必不可少的，將不能磷酸化的人工突變體T34導入宮頸癌細胞株內，可誘導細胞凋亡，增加對化療的敏感性。本研究表明，Survivin在正常宮頸組織中呈現低表達或者不表達狀態(tài)，Survivin正常宮頸組織的表達量

綜上所述，由P-gp、MRP1、Survivin介導的多藥耐藥，與新輔助化療的臨床療效密切相關，其平均光密度值表達越高，預示著化療效果越差。因此聯(lián)合檢測多個耐藥相關蛋白，可以更好地指導臨床化學用藥，選擇有效的個體化治療方案。但是由于本研究的研究對象例數較少，其臨床指導價值需要大樣本多中心對照研究。