microRNA-24作為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的生物標(biāo)志物研究

袁 磊 趙曉玲 王 明 劉 洋 鹿濱麒 黃鸝麗

河南省南陽市第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 473000

腦梗死是一種主要的腦血管疾病，威脅著人類的健康和生命，具有高發(fā)病率、致殘率和死亡率[1]。找到有效的生物標(biāo)志物用于急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的早期診斷至關(guān)重要。血清生物標(biāo)志物的使用被認(rèn)為是常規(guī)臨床檢查和影像數(shù)據(jù)的最有價值的輔助手段。既往研究證明炎癥標(biāo)記物，如hs-CRP和IL-6與腦梗死進展相關(guān)。

miRNA是一類天然存在的非編碼短RNA，可以調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，并發(fā)揮各種重要的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞分化、發(fā)育、免疫應(yīng)答、代謝和癌變。此前的研究表明miRNA在嚙齒動物腦梗死血液和腦細(xì)胞中表達(dá)失調(diào)[2]。有幾種miRNA，包括miR-24，miR-210和miR-223等被報道作為腦梗死的生物標(biāo)志物。microRNA-24 (miR-24), 其序列為5’-UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG-3’，是一種內(nèi)源性非編碼小RNA，其表達(dá)失調(diào)能否對急性動脈粥樣硬化性腦梗死(PCI)進展風(fēng)險進行預(yù)測，或風(fēng)險預(yù)測是否可靠，需要進一步的研究。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究為前瞻性研究。選取2018年6月—2019年5月我院神經(jīng)內(nèi)科收治的急性動脈粥樣硬化性腦梗死患者194例，根據(jù)有無腦梗死進展分為進展組60例和對照組134例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)病24h內(nèi)就診；(2)符合《中國急性缺血性腦卒中診治指南2010》中急性動脈粥樣硬化性腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]；(3)經(jīng)頭顱MRA或CTA證實病因為動脈粥樣硬化。進展型腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn): 1周內(nèi)NIHSS評分增加≥2分[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有意識障礙者；(2)存在心功能衰竭、心房顫動、風(fēng)濕性心臟病等嚴(yán)重心臟疾病者。本研究經(jīng)我院倫理委員會根據(jù)“赫爾辛基宣言—人體醫(yī)學(xué)研究倫理原則”批準(zhǔn)。所有患者均提供書面知情同意書。

1.2 數(shù)據(jù)收集 收集兩組患者的基線特征、常見腦梗死高危因素。

1.3 RNA分離和定量實時PCR 在腦梗死發(fā)病24h內(nèi)，在不添加凝血劑的情況下，將5ml靜脈血收集到血清分離管中。使血液自然凝結(jié)并以1 600轉(zhuǎn)/min離心5min。收集等份的血清立即冷凍，并儲存在-80℃直至分析。

根據(jù)制造商的推薦，使用Trizol Reagent(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)分離總RNA。A260nm/A280nm比率為1.9和28S/18S比率為1.8是后續(xù)PCR的最低要求。用SuperScript Ⅲ First-Strand Synthesis System(Invitrogen)逆轉(zhuǎn)錄總RNA(2μg)。Taqman定量RT-PCR用于miRNA特異性引物擴增(目錄號4427975；Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA，USA)。將反應(yīng)物在96孔光學(xué)板中于95℃溫育5min，然后在95℃下進行40個循環(huán)15s和60℃下1min。在StepOne Plus實時PCR儀(Applied Biosystems)上進行PCR反應(yīng)，并使用2-ΔΔCT方法計算相對表達(dá)。U6(small nuclear RNA，snRNA6)用作內(nèi)部參照。

1.4 血清hsCRP和血清IL-6的濃度 檢測腦梗死發(fā)病后24h內(nèi)血清hs-CRP水平。使用夾心酶聯(lián)免疫吸附(ExCell，Shanghai，China)測定血清IL-6水平，并且所有測定一式兩份進行。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 使用SPSS20.0統(tǒng)計進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計量資料使用t檢驗進行分析。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗。不符合正態(tài)分布的計量資料，使用Kruscal-Wallis和Mann-WhitneyU檢驗或Wilcoxon Signed Rank檢驗進行分析。通過接受者操作特征ROC曲線分析血清miRNA-24作為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的預(yù)測價值。用Spearman試驗進行相關(guān)性分析。雙側(cè)P<0.05被認(rèn)為存在統(tǒng)計學(xué)顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 臨床基線資料比較 進展組糖尿病比例及同型半胱氨酸高于對照組(P<0.05)，兩組其他患者基線特征及常見腦梗死高危因素比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 兩組的血清miRNA-24和血清hsCRP，IL-6水平 進展組和對照組分別測定血清hs-CRP和血清IL-6。進展組與對照組比較，hs-CRP(圖1A)和血清IL-6(圖1B)顯著上調(diào)。進展組與對照組進行比較，血清中miR-24同樣顯著上調(diào)(圖1C)。越來越多的證據(jù)表明，循環(huán)miR-24可能成為急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的生物標(biāo)志物。

2.3 血清miR-24與促炎標(biāo)志物的相關(guān)性 研究結(jié)果顯示，血清miR-24表達(dá)和血清hs-CRP(r=0.523 1)(圖2A)，或IL-6(r=0.530 5)(圖2B)之間存在中度正相關(guān)。

表1 進展組和對照組基線臨床特征

圖1 進展組和對照組血清hs-CRP、IL-6及miR-24水平

2.4 血清miR-24與梗死體積、NIHSS評分的相關(guān)性 據(jù)報道血清hs-CRP水平升高與梗死體積、NIHSS評分呈正相關(guān)，本文目的是驗證血清miR-24的表達(dá)能否反映急性動脈粥樣硬化性腦梗死的嚴(yán)重程度，能否作為腦梗死進展預(yù)測結(jié)果的臨床工具。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清miR-24的表達(dá)與梗死體積(r= 0.519 9，圖3A)和NIHSS評分(r= 0.646 0，圖3C)均呈正相關(guān)。此外，我們根據(jù)梗死體積(>3cm3)

圖2 血清miR-24的表達(dá)與PCI患者血清hs-CRP和IL-6相關(guān)性

或NIHSS評分(>5)將患者分為兩組，本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)梗死體積>3cm3(P<0.001，圖3B)或NIHSS評分>5(P<0.001，圖3D)患者血清miR-24水平顯著增加，這表明的miR-24水平較高可能代表急性動脈粥樣硬化性腦梗死病情較重，易發(fā)生進展。

圖3 血清miR-24的表達(dá)與梗死體積、NIHSS評分相關(guān)性

A & C：使用Spearman方法確定相關(guān)性。B：條形表示中位數(shù)和四分位數(shù)范圍。Mann-WhitneyU檢驗用于統(tǒng)計分析。D：條形表示中位數(shù)和四分位數(shù)范圍。Wilcoxon符號秩檢驗用于統(tǒng)計分析

2.5 血清hs-CRP、IL-6和血清miR-24聯(lián)合用于預(yù)測PCI 通過血清miR-24預(yù)測PCI的ROC曲線下面積(AUC)為0.776(95%CI:0.628～0.813，P<0.001),見圖4。為了進一步評估失調(diào)的miR-24的預(yù)測值，計算hs-CRP、IL-6和miR-24組合的ROC曲線。如表2所示，hs-CRP和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.863,95%CI:0.801～0.936，P<0.001)，比單獨的血清hs-CRP高10.4%。IL-6和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.819,95%CI:0.738～0.892，P<0.001)，其比單獨的血清IL-6高19.7%。此外，hs-CRP、IL-6和miR-24的組合獲得最高的敏感性/特異性(AUC=0.866,95%CI:0.802～0.925，P<0.001)，這與 hs-CRP和miR-24組合非常相似。

圖4 miR-24預(yù)測PCI的ROC曲線

表2 miR-24的ROC值

3 討論

最近研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)miRNA是穩(wěn)定的、可再生的，并且已經(jīng)被提出作為診斷許多神經(jīng)退行性疾病新的非侵入性生物標(biāo)志物[4]。有研究表明，許多循環(huán)miRNA與神經(jīng)血管完整性、功能障礙和卒中介導(dǎo)的炎癥相關(guān)[5-6]。盡管已報道許多循環(huán)miRNA與PCI相關(guān)，但是這些失調(diào)的miRNA是否對于PCI風(fēng)險預(yù)測是可靠的，需要多研究人員進一步驗證。

miR-24是研究最多的miR之一，其在血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cell，VSMCs)的增殖、分化和表型轉(zhuǎn)換中至關(guān)重要。在心血管系統(tǒng)，miR-24不僅對心臟和血管的細(xì)胞分化、增殖很重要，并已被認(rèn)為是血管疾病治療的新靶點[7-8]。炎癥標(biāo)記物例如血清hs-CRP和IL-6在PCI被用作附加的診斷工具，因此，本研究評估了表達(dá)失調(diào)的循環(huán)miR-24和腦梗死進展、hs-CRP或IL-6的相關(guān)性。結(jié)果表明，血清miR-24與腦梗死進展及血清hs-CRP或IL-6呈正相關(guān)，可作為PCI的潛在生物標(biāo)志物。此外，血清miR-24與梗死體積和NIHSS評分呈強陽性相關(guān)。因此，血清的miR-24也可以反映急性動脈粥樣硬化性腦梗死的嚴(yán)重程度，可能用作預(yù)測腦梗死進展的臨床工具。

為了提高診斷的靈敏度和特異性，總是使用多種生物標(biāo)志物的組合。hs-CRP和D-二聚體的組合提高了急性期心源性栓塞的診斷準(zhǔn)確性。較高的hs-CRP水平和脂蛋白相關(guān)的磷脂酶A2(lipoprotein-related phospholipase A2，Lp-PLA2)活性與急性動脈粥樣硬化性腦梗死更嚴(yán)重的神經(jīng)損傷和更大的梗死面積顯著相關(guān)[9]。hs-CRP和同型半胱氨酸是急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展預(yù)后和死亡率的獨立預(yù)測因子[10]。組合模型可以提供更可靠的預(yù)后評估。在本研究中，hs-CRP和miR-24的組合獲得了更高的靈敏度/特異性(AUC=0.863，P<0.001)，比單獨的血清hs-CRP高10.4%，而hs-CRP、miR-24和IL-6的組合獲得了非常相似的靈敏度/特異性(AUC=0.866，P<0.001)。因此，miR-24可能是PCI預(yù)測的潛在生物標(biāo)志物。

本文結(jié)果不僅為miR-24作為PCI評估的新生物標(biāo)志物提供了證據(jù)，而且進一步證實了miR-24在血管病理學(xué)中的重要作用。很多腦梗死發(fā)生、發(fā)展中的細(xì)胞變化都是由miRNA表達(dá)變化介導(dǎo)的，這表明miRNA表達(dá)的分析可以提高對腦梗死發(fā)病機制的認(rèn)識，并發(fā)現(xiàn)腦梗死進展風(fēng)險評估和治療的新途徑。血清miR-24升高是評估急性動脈粥樣硬化性腦梗死進展的潛在生物標(biāo)志物。

本研究也存在一些局限性：首先，由于本研究的單中心和病例數(shù)較少，可能存在由未測量因素造成的殘余混雜；其次，該研究隨訪時間較短。將來需要大規(guī)模的隨機、對照試驗提供長期的臨床分析。