小鼠Nud t9基因原核載體的構建及其生物信息學分析

林艷婷 莊育彬 張東東 胡丁旺 吳香新

（1.福建醫(yī)科大學實驗動物中心 福州 350122；2.福建醫(yī)科大學醫(yī)學技術與工程學院 福州 350004；3.福建醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 福州 350122）

ADP核糖焦磷酸水解酶（Nudt）基因編碼的蛋白質(zhì)屬于Nudix水解酶家族。Nudix盒存在于催化核苷二磷酸衍生物水解的多種酶家族中。這種酶是一種ADP核糖焦磷酸酶，催化ADP核糖水解為AMP和核糖-5-P。它需要二價金屬離子和完整的Nudix基序來進行酶活化。當前人源NUDT9基因在國內(nèi)外受到廣泛關注，已有科學家發(fā)現(xiàn)了人源NUDT9基因編碼不同亞型的剪接轉(zhuǎn)錄變體。NUDT9是一高特異性的ADP-核糖水解酶，在人體細胞內(nèi)主要有兩種轉(zhuǎn)錄形式：NUDT9α和NUDT9β，其中NUDT9α是一種對ADP-核糖和IDP-核糖高選擇性的39kDa線粒體單體蛋白[1-3]，而在NUDT9β多肽上缺少線粒體信號肽，這一現(xiàn)象可能來自于NUDT9α的自剪切[3-4]。有研究表明NUDT9的N端結構域并非水解酶活性必須有的[4]，在NCBIGenBank中，大鼠Nudt9基因也存在兩種變異體，似乎也存在人源NUDT9基因的這種現(xiàn)象。酵母雙雜交實驗顯示其可與C17orf 215相作用，其復合物可阻止線粒體內(nèi)的過度糖基化[3-5]。在已有的研究顯示，陽離子通道TRPM2導致的鈣離子途徑細胞凋亡。而TRPM2細胞內(nèi)C末端結構域與NUDT9極其相似，該通道的關閉被ADP-核糖的緩慢水解所控制[6-8]。原核表達作為結構生物學研究蛋白結構的重要基礎，是結構生物學家們不可缺少的研究技術，同時原核表達也是抗體制備的抗原來源，幫助研究人員制備單克隆抗體和多克隆抗體，一直以來原核表達載體的構建在分子克隆實驗中是不可或缺的實驗技術。本文主要是通過PCR方法擴增小鼠Nudt9基因，將其克隆至原核表達載體，并進行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定，進而對測序結果的基因進行生物信息學分析。蛋白質(zhì)的各種結構及修飾對于蛋白的生物學功能研究具有重要意義，當前研究發(fā)現(xiàn)蛋白的信號肽、抗原肽、跨膜區(qū)域、結構域、磷酸化及糖基化等蛋白特性都是蛋白發(fā)揮生物學功能的重要基礎，生物信息學分析有助于引導科研人員探索蛋白的生物學功能。

1 材料與方法

1.1 材料 質(zhì)粒pCMV-SPORT6-Nudt9（小鼠Nudt9基因，B086-C8）購自武漢淼靈生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Nudt9基因克隆至表達載體 在原引物對的5'端添加酶切位點及保護堿基，PCR擴增得到小鼠Nudt9基因條帶，然后對條帶進行回收純化。純化后的產(chǎn)物與pET-28a（+）載體同時進行雙酶切，及純化回收。酶切產(chǎn)物必須純化回收后方可進行連接，使用T4 DNA Ligase置于4℃進行過夜連接。再進一步的轉(zhuǎn)化及菌群擴增，提取質(zhì)粒進行PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定。將目的基因引物對與載體引物對進行組合PCR鑒定，分別為Nudt9 Forward與Nudt9 Reverse、T7 promoter與T7 terminator、Nudt9 Forward與T7 terminator、Nudt9 Reverse與T7 promoter。PCR鑒定后，在擴大菌群提取進行酶切鑒定，分別為重組質(zhì)粒雙酶切及重組質(zhì)粒單酶切，完成后再送生物公司進行測序，并根據(jù)正確的測序序列繪制重組pET28a-Nudt9圖譜。PCR引物序列見表1。

1.2.2 小鼠Nudt9基因的生物信息學分析 將小鼠Nudt9基因與NCBI基因庫中的基因序列進行BLAST，確保獲取正確的小鼠Nudt9基因，并選取不同的模式生物NUDT9基因運用DNATAR進行同源性分析，具體選取斑馬魚 （Zebrafish nudt9-NM_213352.2）、 牛 （Cattle NUDT9 -NM_001101096.2）、雞 （Gallus XM_420546.6）、人（Human NUDT9-NM_024047.5）、大鼠（Norway rat Nudt9-NM_001006991.1）、 兔 （Rabbit NUDT9-XM_008267620.2）及 普 通 獼 猴 （Rhesus monkey NUDT9-NM_001261782.2）等7個物種的NUDT9基因。為對小鼠Nudt9蛋白的功能進行預測分析，分別運用Signal P 5.0 Server在線軟件分析信號肽、TMHMM分析跨膜區(qū)域以及SMART在線軟件分析結構域，再采用MANMEN分析蛋白多肽的抗原肽、NetNGlyc 1.0 Server在線軟件分析N-糖基化位點以及NetPhos 3.1 Server軟件預測磷酸化位點。

2 試驗結果

2.1 重組質(zhì)粒的鑒定結果 將目的基因引物對與載體引物對進行組合的PCR鑒定結果見圖1，可見第1孔道有一條約為1 069 bp的條帶，第2孔道有一條約為1 295 bp的條帶，第3孔道有一條約為1 153 bp的條帶，第4孔道有一條約為1 208 bp的條帶，與預期結果相符合，說明目的基因插入載體的預期位置。

圖1 重組質(zhì)粒PCR鑒定結果

對重組質(zhì)粒進行酶切鑒定，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后發(fā)現(xiàn)在第3泳道即雙酶切的泳道中有一條約為1 055 bp的條帶，其余泳道在5 000 bp以上出現(xiàn)質(zhì)粒條帶，見圖2。

2.2 測序鑒定及基因序列的生物信息學分析 測序結果表明，小鼠Nudt9基因成功被克隆至表達載體pET-28a（+）上，重組pET28a-Nudt9圖譜見圖3。

2.2.1 小鼠Nudt9基因同源性分析 利用Snapgene軟件，截取小鼠Nudt9基因序列，目的基因片段大小為1 053 bp，與NCBIGenBank在線比對分析。并運用DNAStar-MegAlign進行同源性分析，建立遺傳進化樹。由同源性分析表以及遺傳進化樹可以發(fā)現(xiàn)，重組至pET28a載體上的小鼠Nudt9基因與基因庫中的同源性為100%。由圖4可知，小鼠（5）與大鼠（6）的同源性最高，為92.9%；除斑馬魚（1）和雞（3）外，同源性基本保持在82%以上，其中與人（4）的同源性為82.9%，這很有利于NUDT9基因開展實驗動物研究，對實驗人員來說具有重要意義，便于基因的各項人源化研究。

表1 PCR鑒定相關引物

圖2 重組質(zhì)粒酶切鑒定結果

2.2.2 小鼠Nudt9基因的生物學分析 運用DNAMAN軟件將小鼠Nudt9基因轉(zhuǎn)化為蛋白的氨基酸序列，該蛋白含有350個氨基酸，相對分子質(zhì)量為38.6 kDa，p I為6.74；因載體上有His標簽及腸激酶消化位點，故重組表達蛋白大小為40.8 kDa。

2.2.2.1 信號肽預測 由圖5可知，該蛋白的信號肽約位于第1至第25個氨基酸，第26和第27個氨基酸可能就是信號肽剪切位點。

2.2.2.2 跨膜區(qū)域預測 由圖6可知，該蛋白不存在跨膜區(qū)域，大部分蛋白的氨基酸位于生物膜外部。

2.2.2.3 結構域預測 由圖7可知，通過SMART在線軟件分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白位于約192到331位置處存在140個氨基酸左右的核酸水解酶結構域。

2.2.2.4 抗原肽分析 利用DNAMAN軟件將基因翻譯成氨基酸序列，并分析小鼠Nudt9蛋白的抗原肽。由表2可知，該蛋白可能存在9條抗原肽，其中最長為29個氨基酸，最短為6個氨基酸。15個氨基酸以上的有5條，用于單克隆抗體制備已具備較多的選擇性。

圖3 原核表達質(zhì)粒pET28a-Nudt9圖譜

圖4 小鼠Nudt9基因同源性分析

圖5 小鼠Nudt9蛋白氨基酸序列信號肽位點分析

2.2.2.5 磷酸化位點預測 磷酸化是基因翻譯后修飾的重要活化方式，對小鼠Nudt9蛋白進行磷酸化位點預測，見圖8。在該蛋白上存在38個磷酸化位點，其中絲氨酸的磷酸化位點21個，蘇氨酸的磷酸化位點11個，酪氨酸的磷酸化位點有6個。

2.2.2.6 N-糖基化位點預測 利用在線軟件Net-NGlyc 1.0 Server對小鼠Nudt9蛋白的糖基化位點進行分析，有糖基化可能性的氨基酸約19個，達到閾值的糖基化位點有13個，見圖9。

3 討 論

1）經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定以及測序鑒定，本研究成功獲得小鼠Nudt9基因的原核表達載體，該重組表達質(zhì)粒pET28a-Nudt9將被用于小鼠Nudt9蛋白的大腸桿菌表達，繼續(xù)開展結構生物學和各類抗體的制備實驗。

圖6 小鼠Nudt9蛋白跨膜區(qū)域預測

圖7 小鼠Nudt9蛋白的結構域預測

表2 小鼠Nudt9蛋白抗原肽分析

2）已有研究人員發(fā)現(xiàn)了人源NUDT9基因編碼不同亞型的剪接轉(zhuǎn)錄變體，在NCBI基因庫中已有三種轉(zhuǎn)錄變異體。這一現(xiàn)象存在于多種模式生物中，在查找不同物種的NUDT9基因時，發(fā)現(xiàn)大鼠、雞、擬南芥等模式生物存在不同的mRNA變異體，但較長的序列一般都包含了較短的序列，有研究預測該基因似乎在生物體中存在自剪切現(xiàn)象，但機制尚不清楚[9]；在NCBI基因庫中存在第三種人源NUDT9（GenBank ID：NM_001248011.1），在該變異體上中間位置缺失96個核苷酸，是否存在類似于細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激情況下IRE1對xbp-1的剪切現(xiàn)象[10]，尚待考查。在大鼠兩個變異體中，其中一條變異體序列被包含在另一條變異體中。在NCBI庫中查找雞和兔Nudt9的CDS（Coding sequence，編碼區(qū)）時，發(fā)現(xiàn)其mRNA有三種變異體，雖然有幾個堿基存在差異，但是有一條較長序列，已經(jīng)包含了其他兩條較短序列，情況與人源NUDT9基因相似，因而也可能存在自剪切及其他修飾的可能性。

3）同源性分析表明，小鼠Nudt9與人源NUDT9基因具有較高同源性，有助于研究人員開展人源化相關實驗，搜索人源化基因在實驗動物上的研究。該蛋白的氨基酸序列含350個氨基酸，本研究預測結果發(fā)現(xiàn)，在該多肽上存在信號肽，但不含有跨膜區(qū)域，可能不會存在較多的主動跨膜行為；在其肽鏈上含有140個氨基酸左右的核酸水解酶結構域，位于肽鏈的末端。從其抗原肽上來看，長度適中，有兩條抗原肽為26個和29個氨基酸，對于制備多克隆抗體，乃至單克隆抗體具有重要意義。

4）基因在經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄翻譯后，為發(fā)揮其蛋白功能會發(fā)生一些磷酸化或者糖基化，其中蛋白質(zhì)磷酸化是最常見、最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動，通過蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化，調(diào)控信號轉(zhuǎn)導、基因表達、細胞周期等諸多細胞過程[11]。本研究磷酸化位點預測發(fā)現(xiàn)，小鼠Nudt9蛋白上存在38個磷酸化位點，可見其在細胞內(nèi)扮演著重要作用，值得深入研究。蛋白質(zhì)的糖基化是糖類在糖基轉(zhuǎn)移酶（Glycosyhransferase，GTs）的催化下以共價鍵的形式與肽鏈連接的過程[12]，近年來晚期糖基化終末產(chǎn)物（Advanced Glycation End Products，AGEs）成為了全球醫(yī)學界最為熱門的領域之一，有眾多的科研機構、大學、醫(yī)院以及制藥公司紛紛加入研究AGEs的行列，以期通過研究，緩解并治療人體的衰老和很多慢性退化型疾病的發(fā)生。由此產(chǎn)生的糖基化終末產(chǎn)物受體（Advanced Glycosylation End Product Specific Receptor，AGER）也是科研人員研究的重點，在小鼠Nudt9蛋白上游13個超過閾值的糖基化位點以及6個可能存在的糖基化位點，如此之多的糖基化位點對于形成AGEs是一種較大的威脅，值得關注。且在其與人源NUDT9基因同源性達82.9%的情況下，通過對該基因的研究，進而拓展至人類疾病的研究具有重要意義。

圖8 小鼠Nudt9蛋白磷酸化位點預測

圖9 小鼠Nudt9蛋白糖基化位點預測