蛙腦膜炎敗血金黃桿菌分離株的藥敏試驗

曾彥欽 林秋娟 潘 平 陳 震 林福忠 蔡鶴鳴 福州市農(nóng)業(yè)科學研究所 福州 350008

蛙腦膜炎敗血金黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum of frog）在《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第二版中的分類名稱是腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingiameningoseptica），是蛙白內(nèi)障-歪頭病的主要病原菌。臨床上，患蛙的癥狀為歪頭斜頸、白內(nèi)障、在水面上轉(zhuǎn)圈、皮膚潰爛。大小蛙都會患該病，成蛙更常見，發(fā)病率可達50～80%，若無有效治療，患蛙基本都死亡，蛙場的損失很大。從建陽某蛙場分離出6株蛙腦膜炎敗血金黃桿菌，對其進行21種抗生素敏感性試驗，現(xiàn)將詳情報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥敏紙 由Oxoid ltd.Basingstoke(Hampshire Englang)生產(chǎn)，批號2019-05。

1.1.2 細菌培養(yǎng)和生化鑒定材料 AHM培養(yǎng)基、RS培養(yǎng)基、甲苯胺藍-DNA酶瓊脂、各種細菌生化鑒定管和鑒定試劑，由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。麥康凱瓊脂、普通營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯、蛋白凍由北京陸橋技術(shù)股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 健康成蛙 從德化某無病健康蛙場購得，體重175～235 g，每只先喂服紅霉素7mg（有效成分），連喂服3 d，再觀察7 d，確定健康無病，備用。

1.2 方法

1.2.1 蛙腦膜炎敗血金黃桿菌分離與鑒定

1.2.1.1 病原菌分離 無菌操作取患蛙腦組織和心血，分別接種普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、RS培養(yǎng)基瓊脂平板，35℃培養(yǎng)48 h。普通營養(yǎng)瓊脂上的菌落光滑圓整、半透明、微隆起、淺黃色、濕潤、直徑0.8～1.2 mm，接近純培養(yǎng)。麥康凱瓊脂上菌落生長貧瘠，培養(yǎng)72 h后菌落直徑0.3～0.5 mm。RS培養(yǎng)基平皿上無菌落生長。

選普通營養(yǎng)瓊脂上的典型代表性菌落，以氧化酶試紙和過氧化氫酶試劑檢測所選菌落，氧化酶和過氧化氫酶均呈強陽性；挑取氧化酶和過氧化氫酶試驗均呈陽性得菌落，再畫線接種于普通營養(yǎng)瓊脂，培養(yǎng)48 h，獲純培養(yǎng)物。

1.2.1.2 鏡檢 純培養(yǎng)物革蘭氏染色，12.5×100倍油鏡下觀察呈革蘭氏陰性短小桿菌。

1.2.1.3 細菌生化試驗 挑取純培養(yǎng)物，穿刺AHM試管斜面，接種七葉苷、明膠、葡萄糖、ONPG生化鑒定管。在AHM試管斜面上，48 h，培養(yǎng)基不變色仍為淺紫紅色，線狀生長不運動，底部生長不良，表層生長良好為好氧，無氣泡。24 h七葉苷黑色強陽性，48 h明膠液化（6℃）陽性，ONPG黃色陽性或陰性，72 h葡萄糖發(fā)酵弱陽性。其它細菌生化試驗結(jié)果（48～72 h）為：DNA酶試驗陽性、尿素酶試驗陽性(初次分離株為陽性，部分菌株傳代后轉(zhuǎn)為陰性)、半乳糖發(fā)酵弱陽性、果糖發(fā)酵弱陽性。枸櫞酸鹽試驗陰性、V-P試驗無色陰性、靛基質(zhì)試驗陰性、硫化氫試驗陰性、甘油試驗陰性、硝酸鹽還原試驗陰性、半固體培養(yǎng)基線狀生長、蔗糖陰性、麥芽糖陰性、甘露醇陰性、海藻糖陰性、水解淀粉陰性，甲基紅試驗陰性、阿拉伯糖發(fā)酵陰性、水楊苷發(fā)酵陰性、乳糖發(fā)酵陰性。賴氨酸脫羧酶試驗陰性、鳥氨酸脫羧酶試驗陰性、精氨酸雙水解酶試驗陰性。

1.2.2 動物試驗 將分離到的3腦株和4腦株（氧化酶、過氧化氫酶、七葉苷、明膠液化、ONPG和DNA酶試驗均呈強陽性）分別接種營養(yǎng)肉湯，以其48 h培養(yǎng)物各0.1mL混合成0.2mL，背部皮下注入健康成蛙（試驗組4只，對照組3只）。試驗成蛙注射菌液后的第24 h，注射局部充血腫脹，48 h后針口破潰發(fā)白，72 h后背部皮膚大面積破潰，分別于注射菌液后90～120 h死亡，但無發(fā)現(xiàn)歪頭和白內(nèi)障癥狀。剖檢，注射局部皮膚破潰，肝腎充血腫大、有出血斑。無菌采取瀕死試驗蛙心血，分離出蛙腦膜炎敗血金黃桿菌。對照組3只成蛙均存活。

1.2.3 藥敏試驗 先將6株蛙腦膜炎敗血金黃桿菌分別接種于普通營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)36 h，以接種環(huán)釣取菌落混于無菌生理鹽水中，再以無菌棉簽蘸取菌液，均勻涂抹于普通營養(yǎng)瓊脂平板，涂滿不留空隙。再以鑷子夾取藥敏紙片貼在待測菌的瓊脂平板上，并用鑷子輕壓紙片。注意無菌操作和編號。培養(yǎng)24～36 h，測量抑菌圈直經(jīng)。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗結(jié)果 紅霉素（23.8 mm）、阿奇霉素（20.8mm）為相對高效藥物；中效藥物從高到低依次為氟苯尼考（19.3 mm）、強力霉素（18.3 mm）、萬古霉素（15.5mm）、壯觀霉素（14.7mm）、頭孢派酮（14.3mm）；低效藥物有蒽諾沙星（11.8mm）和阿米卡星（9.8 mm）；慶大霉素（0 mm）、氧氟沙星（4.3mm）、環(huán)丙沙星（0 mm）、諾氟沙星（0mm）、頭孢噻吩（0 mm）、阿莫西林（0 mm）、氨卞西林（0 mm）、多粘菌素（0 mm）、復方新諾明（0 mm）、四環(huán)素（2.6 mm）、桿菌肽（0 mm）、鏈霉素（4.1 mm）為無效藥物。

2.2 治療效果 根據(jù)藥敏試驗結(jié)果，選擇相對高效的藥物對原發(fā)病蛙場（建陽蛙場）進行治療。按每千克蛙重使用水溶性硫氫酸紅霉素20 mg（有效成分）、氟苯尼考可溶性粉20 mg（有效成分），合用治療。先估算每池蛙的只數(shù)，再估算每池蛙的總蛙重，算出每池蛙的2種藥用量。先以適量水溶解硫氫酸紅霉素和氟苯尼考可溶性粉，再攪拌均勻混入蛙食料。全場用藥5 d，停藥3 d，再用藥3 d。經(jīng)治療，蛙群基本停止死亡。停藥后，直至蛙售完近50 d，未再使用任何抗生素。

表1 21種抗生素對6株蛙腦膜炎敗血金黃桿菌的抑菌圈直徑（mm）

3 討論與小結(jié)

1）參照《伯杰氏系統(tǒng)細菌學手冊》第二版中的黃桿菌科（Flavobacteriaceae）、伊麗莎白菌屬（Elizabethkingia）內(nèi)容，對分離菌進行鑒定，確定其為腦膜炎敗血伊麗莎白菌 （Elizabethkingia meningoseptica），即蛙腦膜炎敗血金黃桿菌。

2）藥敏試驗結(jié)果表明，分離菌株對抗生素的耐藥性很嚴重，很多在畜牧水產(chǎn)上常用的抗生素如磺胺類、青霉素類、氨基糖苷類、喹諾酮類已基本失效，就連目前人醫(yī)常用的頭孢派酮（新藥）也只是中效藥物。腦膜炎敗血金黃桿菌可引起新生兒腦膜炎和醫(yī)院獲得性感染，被感染病人具有較高的死亡率。近些年來，伊麗莎白菌屬導致的臨床感染越來越多，逐漸引起公共衛(wèi)生部門的關(guān)注[1]。

3）蛙的養(yǎng)殖密度很高，一定要有充足的潔凈水源（最好是深井水或水庫源頭水），不可用別的水產(chǎn)生物養(yǎng)殖場的廢棄水。蛙腦膜炎敗血金黃桿菌病的防疫應(yīng)從水源、引種、隔離、消毒等多方面入手。