毛細管電泳測定尿液中7種核苷含量

曹志龍

（武警兵團總隊醫(yī)院 新疆 烏魯木齊 830011）

核苷，作為維持細胞生命活動所需的基本物質(zhì)是核酸的主要組分，核苷及其衍生物均具有顯著的生理功能[1]，機體中除含有基本的正常代謝核苷（腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶及尿嘧啶）外，還有大量修飾核苷，包括次黃嘌呤、假尿核苷等。修飾核苷[2-3]是正常核苷在機體內(nèi)特異酶作用下生成的不易被磷酸酯化的產(chǎn)物。修飾核苷十分穩(wěn)定，在尿中可以被定量排泄，因此尿中修飾核苷的排泄往往反映了機體RNA降解速率。正常人核苷排放濃度差異很小，但當(dāng)機體發(fā)生病理性變化如細胞癌變時，核糖核酸周轉(zhuǎn)會加快，尿液中各種修飾核苷的含量相應(yīng)增加，因此定量快速分析各種核苷類成分的含量可以對癌癥的發(fā)病進行診斷[4-6]。

高效液相色譜技術(shù)是最常見的分析尿中核苷的分析方法。蔣玉萍[7]等采用反相高效液相色譜法分別對宮頸癌、卵巢腺癌、卵巢胚胎癌患者尿中假尿核苷的水平進行測定，結(jié)果顯示尿中假尿核苷可以作為區(qū)分良性、惡性卵巢腫瘤的重要標(biāo)志物。近年來，高效毛細管電泳分析技術(shù)由于有著分離效率高、分析時間短、樣品用量少、自動化程度高等優(yōu)點已被廣泛應(yīng)用于尿液、中藥等物質(zhì)中核苷類化合物的分析[8-10]。

本文采用高效毛細管電泳法對尿液中7種核苷類成分進行定性定量分析，希望建立一種快速檢測尿液中核苷的分析方法，為癌癥患者的早期確診及于臨床監(jiān)測提供數(shù)據(jù)支持。

1.儀器與材料

1.1 儀器

Beckman P/ACE MDQ型高效毛細管電泳儀,配二極管陣列檢測器(DAD)及32Karat軟件控制儀器操作（美國）；雷磁PHS-2F型酸度計(上海精科公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司)；Mettler Toledo十萬分之一分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)，SIGMA2-16K型離心機。

1.2 材料

對照品：胸苷(Thymidine 批號：1001419412)、尿苷 (uridine批號：10002581110)，鳥嘌呤 (uracil，批號10002541230)，次黃嘌呤(hypoxanthine批號1001392974），鳥苷 (guanosine批號1001229937)，胸腺嘧啶(thymine 批號1012253008)，腺苷（adenosine批號：10001235421）以上對照品均購自SIGMAALDRICH公司（純度均大于98%）。硼砂，氫氧化鈉，磷酸二氫鈉，無水乙醇，以上試劑均為分析純。實驗用水均為超純水(Millipore)。

健康志愿者尿樣： 由新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院提供。

2.方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

用十萬分之一分析天平分別精密稱取放置于干燥器中的鳥嘌呤，胸苷，胸腺嘧啶、鳥苷、次黃嘌呤、腺苷、尿苷10mg，置10mL容量瓶中加水超聲溶解并定容，搖勻得各對照品儲備液。精密吸取各儲備溶液適量至10mL容量瓶中，加水定容至刻度，配制成7種對照品質(zhì)量濃度為100μg/mL混合對照品溶液。

2.2 樣品處理

收集受試者24h尿樣5mL，立刻放入-20℃的冰箱中凍存。測定前于室溫下溶解后，精密移取200μL至于超濾離心管中，使用低溫離心機12000r?min-1，4℃離心15min，將上清液轉(zhuǎn)出，作為供試品溶液備用。

2.3 電泳條件

未涂層標(biāo)準(zhǔn)熔融石英毛細管(75μm×64.5cm，有效長度56cm；檢測波長254nm；壓力進樣5kPa，5s；電壓20kV；毛細管溫度25℃；運行緩沖液：100mmol?L硼砂（Ph9.36）；毛細管使用前以0.1mol/L鹽酸，蒸餾水，0.1moL/L氫氧化鈉溶液、蒸餾水和運行緩沖液依次通過壓力沖洗3min，上述試劑使用前均經(jīng) 0.45μm微孔濾膜濾過，并超聲脫氣。

2.4 樣品中各核苷峰的確定

將尿樣中未知峰的遷移時間與混標(biāo)中各核苷組分的遷移時間做對照，并將單個核苷組分的標(biāo)準(zhǔn)溶液分別加入到尿樣中對比峰面積的變化用于定性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線定量、檢測限與定量限

精密吸取混合對照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL于 10mL量瓶中用水定容至刻度，將稀釋好的不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進樣分析，建立核苷濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表1，色譜圖見圖1。

表1 7種核苷對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測限

2.6 精密度、穩(wěn)定性實驗

取固定濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)進樣5次，分別測得7種指標(biāo)性核苷成分峰面積的RSD值，考察精密度，結(jié)果見表2，由表2見相對峰面積的RSD均小于5.0%，表明儀器精密度良好。

取尿液樣品，分別在0，2，4，8，12h進樣5次，測得7種核苷成分相對峰面積的RSD均5.0%，表明穩(wěn)定性良好，見表3。

表2 混合標(biāo)準(zhǔn)品中7 種核苷精密度實驗

表3 樣品中7 種核苷穩(wěn)定性實驗

2.7 加樣回收率實驗

精密移取已知濃度的尿液樣品，加入一定濃度的對照品溶液，按“2.3”項下供試品液制備方法制備加樣回收供試品溶液，并按照樣品測定方法進樣分析，計算回收率，見表4。

表4 加樣回收率

2.8 樣品分析

將供試品液按照“2.3”電泳條件下，進樣分析。根據(jù)7種成分的線性回歸方程計算尿液中胸苷，鳥嘌呤，胸腺嘧啶，腺苷，次黃嘌呤，鳥苷，尿苷7種核苷的含量，見表5。

表5 尿液中核苷含量

3.討論

由于核苷在pH接近中性時是不帶電的，因此本次試驗選擇在堿性條件下對核苷進行分離，本實驗采用硼砂作為電泳分離的緩沖液體系。配制了不同濃度的硼砂緩沖溶液，考察濃度對分離的影響。結(jié)果表明：當(dāng)硼砂濃度為20mmol/L～100mmol/L時，被分析物能得到基本分離，雖然遷移時間會隨著硼砂濃度的增高而延長，但分離度會逐漸改善，最終實驗選擇100mmol/L的硼砂作為分離體系。

pH會影響帶電組分遷移的速度及電滲流的大小，從而影響被測物的遷移時間及分離度。在硼砂緩沖體系中考察了pH9.0～10.0的范圍，結(jié)果顯示，在pH9.36條件下各組分能得到基線分離，因此最終選擇9.36作為最佳條件。

電壓對被分析物的遷移時間及分離度的影響很大，是～個重要的參數(shù)。電壓升高時，被測物遷移速度變快，從而遷移時間縮短，可節(jié)省時問，利于快速分離。但當(dāng)電壓增加到一定程度時，則被測物的分離度會下降，基線會出現(xiàn)漂移。通過實驗考察，最終選擇的工作電壓為20kV，在此電壓下，核苷的分離效果良好。

尿液中核苷的測定被認為是評價腫瘤患者病程輕重的重要指標(biāo)。目前文獻報道的方法多為高效液相色譜法，樣品制備需要經(jīng)過過濾，離心，調(diào)節(jié)pH甚至富集等多個環(huán)節(jié)，這種處理方法可能造成待測物質(zhì)丟失或引入新的污染物質(zhì)，且回收率低。本實驗采用樣品直接經(jīng)超濾離心管低溫高速離心后，直接進樣分析測定，方法學(xué)驗證顯示此方法精密度、穩(wěn)定性、回收率均符合要求，具有簡單、快速的特點，采用生物樣本尿液進行測定可以對尿液中7種核苷進行定量計算，用在臨床標(biāo)本檢測中。但是由于尿液中7種核苷成分含量差異顯著，因此有個別核苷測定值超出了線性范圍，應(yīng)該在后續(xù)的研究中重點討論。