土壤滲濾處理老齡養(yǎng)豬廢水堵塞的光譜學(xué)和微生物學(xué)分析

呂晶晶, 龔為進(jìn), 竇艷艷, 段學(xué)軍, 劉海芳, 張列宇, 席北斗, 于水利, 侯立安,4

1. 中原工學(xué)院能源與環(huán)境學(xué)院, 河南 鄭州 450007 2. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院, 上海 200092 3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院, 北京 100012 4. 火箭軍后勤科學(xué)技術(shù)研究所, 北京 100190

引 言

廣大的農(nóng)村地區(qū)，小規(guī)模的生豬養(yǎng)殖會(huì)產(chǎn)生養(yǎng)豬廢水，這類養(yǎng)豬廢水大多露天存放在泥坑塘中，從而變?yōu)槔淆g養(yǎng)豬廢水，老齡養(yǎng)豬廢水如果處理不當(dāng)會(huì)引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化。人工濕地、氧化塘和土壤滲濾等生態(tài)法是處理老齡養(yǎng)豬廢水的比較理想的模式，但是也存在易堵塞、不穩(wěn)定等問題。

土壤滲濾系統(tǒng)發(fā)生堵塞，會(huì)導(dǎo)致系統(tǒng)水力傳導(dǎo)系數(shù)降低，處理能力下降，影響出水水質(zhì)[1]。堵塞問題的產(chǎn)生大大降低了土壤滲濾系統(tǒng)的大范圍推廣和應(yīng)用[2]。堵塞已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，成為研究土壤滲濾、人工濕地等生態(tài)處理方法的熱點(diǎn)問題之一。本研究主要運(yùn)用紫外、紅外、三維熒光等光譜學(xué)分析方法和高通量測(cè)序的微生物學(xué)方法探討堵塞形成的機(jī)理，以期為解決土壤滲濾處理老齡養(yǎng)豬廢水時(shí)的堵塞問題提供科學(xué)依據(jù)，擴(kuò)展土壤滲濾推廣應(yīng)用范圍。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與方法

采用日立F-7000型熒光分光光度計(jì)掃描污水中溶解性有機(jī)物(dissolved orgainic matter, DOM)的三維熒光圖譜前，首先根據(jù)所測(cè)污水中的總有機(jī)碳濃度(TOC)濃度，再對(duì)該TOC濃度對(duì)樣品進(jìn)行一定倍數(shù)的稀釋，使測(cè)定水樣的TOC處于一個(gè)合適的范圍(TOC=10 mg·L-1左右)，從而得到比較有效的三維熒光圖譜。得到的三維熒光數(shù)據(jù)在進(jìn)行深度處理之前進(jìn)行歸一化處理，即原始數(shù)據(jù)除以TOC值。儀器參數(shù)設(shè)置： 激發(fā)光源為150 W氙弧燈，光電倍增管電壓為700 V，信噪比>110，掃描速度12 000 nm·min-1，激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫寬度均為10 nm，響應(yīng)時(shí)間為自動(dòng)。測(cè)定時(shí)狹縫寬度均為5 nm，激發(fā)波長(zhǎng)范圍設(shè)為200～400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍設(shè)為280～500 nm，激發(fā)和發(fā)射光譜增量5 nm[3]。取適量進(jìn)出水濾液樣品在-20 ℃冷凍成冰塊后，-60 ℃抽真空冷凍干燥，將所得固體粉末樣品以質(zhì)量比1∶100與KBr(光譜純)混合均勻，在紅外燈下研磨，再于50～100 MPa下壓片測(cè)紅外光譜。采用美國(guó)Nicolet5DX傅里葉紅外光譜儀，掃描范圍在4 500～400 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)16次[3]。采用UNICO/UV-4802型紫外分光光度計(jì)，掃描波長(zhǎng)范圍為190～700 nm，掃描間距為1 nm。

試驗(yàn)裝置如圖1所示。反應(yīng)器為高50 cm，內(nèi)徑為4 cm的有機(jī)玻璃管，其中填充的土壤為北京市順義區(qū)試驗(yàn)基地內(nèi)表層土。

圖1 反應(yīng)裝置示意圖Fig.1 Schematic diagram of reaction device

1.2 進(jìn)水水質(zhì)

試驗(yàn)用水為稀釋了10倍的老齡養(yǎng)豬廢水，進(jìn)水水質(zhì)情況如表1所示。廢水通過蠕動(dòng)泵提升進(jìn)入反應(yīng)器，水力負(fù)荷為6 cm·d-1，系統(tǒng)前端未加預(yù)曝氣系統(tǒng)。反應(yīng)器的初始水力傳導(dǎo)系數(shù)為3 m·d-1，隨后逐漸減小，運(yùn)行了10 d之后，水力傳導(dǎo)系數(shù)降為0.005 m·d-1，并且土壤表層存在積水，

表1 稀釋老齡養(yǎng)豬廢水水質(zhì)Table 1 The water quanlity of synthetic highammonia nitrogen waste water

土壤滲濾系統(tǒng)發(fā)生了堵塞。實(shí)驗(yàn)中取堵塞前、堵塞時(shí)和堵塞后的三次進(jìn)出水水樣，進(jìn)行光譜學(xué)分析，并取堵塞時(shí)的表層土壤、底層土壤和原位土壤做細(xì)菌和真菌的DNA編碼分別為16S，18S rDNA。

2 結(jié)果與討論

2.1 堵塞的光譜學(xué)分析

圖2(a)—(f)分別為用MATLAB R2009a處理過之后去除了拉曼散射和瑞利散射之后的DOM三維熒光圖譜。由圖2(a)—(f)可以直觀的看到，堵塞前后，土壤滲濾系統(tǒng)對(duì)DOM的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生了很大影響。進(jìn)水中的DOM主要為類酪氨酸、類色氨酸和溶解性微生物副產(chǎn)物[見圖2(a)，(c)，(e)]，屬于類蛋白物質(zhì)，系統(tǒng)完全堵塞之前，經(jīng)過處理之后，DOM轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛焕锼幔瑢儆陬惛迟|(zhì)類物質(zhì)。而當(dāng)系統(tǒng)發(fā)生了堵塞，DOM的組成基本不變，只是進(jìn)水中原本存在的類蛋白峰發(fā)生了微弱的紅移，有發(fā)生轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度減弱，表明DOM的濃度減小。

研究表明，紫外-可見吸收光譜可以揭示DOM組成的宏觀信息。圖4為堵塞前后DOM的紫外-可見吸收特征光譜圖。表3為堵塞前后DOM的紫外-可見吸收光譜特征參數(shù)。a355m-1為波長(zhǎng)為355 nm處的吸光系數(shù)[9]，通過公式a355=A355×2.303/L計(jì)算，其中A355為波長(zhǎng)355 nm對(duì)應(yīng)的吸光度，L為光程即比色皿寬度0.01 m；E253/E203為波長(zhǎng)253 nm處的吸光度與203 nm處的吸光度比值；SR為ln(275)～ln(295)和ln(350)～ln(400)擬合直線斜率的比值； SUVA254為波長(zhǎng)254 nm處單位DOC濃度的吸光度，通過公式SUVA254=100×A254/DOC計(jì)算；A226～250和A260～400分別為對(duì)波長(zhǎng)226～250 nm和波長(zhǎng)260～400 nm范圍內(nèi)的吸光度做面積積分所得的值[1]。

圖3 堵塞前后溶解性有機(jī)物傅里葉變換紅外光譜Fig.3 FTIR spectra of DOM before and after cloggings

a355為表征有色DOM濃度的重要指標(biāo)，堵塞前、堵塞時(shí)及堵塞后系統(tǒng)對(duì)a355的去除率分別為17.26%，37.24%和48.08%，可見堵塞的發(fā)生對(duì)去除有色DOM濃度是有利的，這是由于堵塞使進(jìn)水的水力停留時(shí)間變長(zhǎng)所導(dǎo)致的。E253/E203可以代表有機(jī)質(zhì)芳香環(huán)上的取代基種類和程度，當(dāng)取代基中脂肪鏈含量越多時(shí)其值越小，當(dāng)取代基中羰、羥基、羧基及酯類含量增多時(shí)，該值則變大，堵塞過程中，該值變小，表明DOM芳香環(huán)取代基中脂肪鏈的含量增多。SR值的大小與有機(jī)物分子量有關(guān)，此值越大，有機(jī)物分子量越小，堵塞過程中，該值變小，表明有機(jī)物分子量變大。SUVA254值越大，EOM的芳香性就越大[2]，其組分中包含的含苯環(huán)化合物就越多，堵塞發(fā)生后，該值變小，表明出水組分中含苯化合物減少。波長(zhǎng)226～250 nm處的吸收帶主要由不飽和π—π鍵產(chǎn)生，波長(zhǎng)260～400 nm處吸收帶主要由苯環(huán)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，因此該波段吸收峰面積積分大小A226～250和A260～400能體現(xiàn)大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)變化信息，堵塞發(fā)生時(shí)這兩個(gè)值均變小，表明出水中大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)減少，這與其他幾個(gè)紫外吸收特征指標(biāo)結(jié)果相一致。

表2 堵塞前后傅里葉紅外光譜特征峰對(duì)應(yīng)的化合物和官能團(tuán)Table 2 Compounds and functional groups correspondingto the FTIR peaks before and after cloggings

圖4 堵塞前后DOM紫外-可見吸收特征光譜Fig.4 UV-Vis absorption spectra of DOMbefore and after cloggings

表3 堵塞前后溶劑性有機(jī)物的紫外-可見吸收光譜特征參數(shù)Table 3 UV-Vis absorption spectral characteristicparameters of DOM

注： a和b分別表示堵塞前進(jìn)、出水，c和d分別表示堵塞時(shí)進(jìn)、出水，e和f分別表示堵塞后進(jìn)、出水

2.2 堵塞的微生物學(xué)分析

為了闡釋堵塞發(fā)生的微生物學(xué)機(jī)理，取堵塞時(shí)的表層土壤S1、底層土壤X1，做了細(xì)菌和真菌的16S rDNA和18S rDNA，同原位土壤Y1的菌群進(jìn)行微生物多樣性分析比較。細(xì)菌16S樣品PCR擴(kuò)增引物為338F_806R，真菌18S樣品PCR擴(kuò)展引物為SSU0817F_1196R。PCR擴(kuò)增完成后進(jìn)行純化，并用Picogreen染料熒光計(jì)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量并均一化混勻，而后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina MiSeq，測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成，部分生物信息分析在該公司的I-Sanger云平臺(tái)上完成。

本研究通過Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)來研究環(huán)境中微生物的多樣性。Simpson指數(shù)值越大，表明群落多樣性越低。Shannon值越大，表明群落多樣性越高。計(jì)算出細(xì)菌16S rDNA在OUT水平下原位土壤Y1、表層土壤S1、底層土壤X1的Simpson指數(shù)分別為0.004 4，0.057 3和0.004 0，Shannon指數(shù)分別為5.877 0，4.560 8和6.037 4； 真菌18S rDNA在OUT水平下原位土壤Y1、表層土壤S1、底層土壤X1的Simpson指數(shù)分別為0.105 2，0.328 8和0.097 9，Shannon指數(shù)分別為2.794 9，1.506 8和2.879 8。從Simpson指數(shù)來看，細(xì)菌16S rDNA的群落多樣性為X1>Y1>S1； 真菌18S rDNA的群落多樣性也為X1>Y1>S1。并且細(xì)菌的群落多樣性大于真菌的群落多樣性。堵塞時(shí)表層土壤S1的群落多樣性最低，分析認(rèn)為由于表層土壤受到進(jìn)水的沖擊負(fù)荷最大。底層土壤X1的群落多樣性最大，比原位土壤Y1的群落多樣性要大，表明土壤滲濾系統(tǒng)中的污水進(jìn)入土壤之后微生物群落多樣性增加，比較三者微生物群落組成特性，有可能揭示引發(fā)堵塞的主要微生物群落。

真菌中，S1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Gammaproteobacteria(相對(duì)豐度36.5%)γ-變形桿菌綱，Betaproteobacteria(13.4%)β-變形菌綱，Actinobacteria(11.5%)放線菌綱和Alphaproteobacteria(8.5%)α-變形菌綱； Y1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Actinobacteria(36.2%)放線菌綱，Alphaproteobacteria(18.7%)α-變形菌綱，Acidobacteria(8.7%)酸桿菌綱和Betaproteobacteria(7.2%)β-變形菌綱； X1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Actinobacteria(22.8%)放線菌綱，Acidobacteria(15.5%)酸桿菌綱，Alphaproteobacteria(12.8%)α-變形菌綱和Clostridia(10.4%)梭狀芽孢桿菌綱。可見，三樣品在綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌都含有Actinobacteria和Alphaproteobacteria兩類。S1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有Arenimonas(22.2%)鐵礦沙單孢菌，Ramlibacter(4.6%)分枝桿菌和Nannocystis(3.4%)納囊藻屬； Y1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank _c_Acidobacteria(6.0%)酸桿菌綱，norank _f_Nitrosomonadaceae(3.6%)亞硝化單胞菌屬和Gaiella(2.6%)； X1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank_c_Acidobacteria(11.4%)嗜酸細(xì)菌屬，norank _c_KD4-96(3.7%)和Gracilibacter(2.8%)纖細(xì)桿菌屬。

細(xì)菌中，S1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括unclassified_d_Eukaryota(相對(duì)豐度49.8%)真核生物綱，Intramacronucleata(40.0%)髓內(nèi)核瘤綱，Sordariomycetes(3.4%)糞殼菌綱和Eurotiomycetes(2.1%)散囊菌綱； Y1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Sordariomycetes(37.2%)糞殼菌綱，Dothideomycetes座囊菌綱(30.5%)，Eurotiomycetes(10.0%)散囊菌綱和norank_k_Fungi(5.4%)真菌綱； X1樣品中綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要包括Sordariomycetes(45.6%)糞殼菌綱，norank_k_Fungi(13.6%)真菌綱，Dothideomycetes(11.6%)座囊菌綱和Eurotiomycetes(10.4%)散囊菌綱?？梢姡瑯悠穀1和X1在綱一級(jí)的優(yōu)勢(shì)真菌完全相同。S1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有unclassified_d_Eukaryota(49.8%)真核生物，norank_f_Colpodea(22.3%)有足類纖毛蟲和Pseudoplatyophyra(17.4%)假盤藻； Y1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有unclassified_o_Pleosporales(25.4%)格孢腔菌，norank _o_Sordariales(17.2%)糞殼菌和Fusarium(14.5%)鐮刀菌； X1樣品中屬一級(jí)的優(yōu)勢(shì)菌主要有norank _o_Sordariales糞殼菌(21.5%)，unclassified_o_Sordariales糞殼菌(13.9%)和norank_k_Fungi(13.6%)真菌。

3 結(jié) 論

(1)系統(tǒng)完全堵塞之前，經(jīng)過處理之后，DOM轉(zhuǎn)變?yōu)轭惛焕锼?，屬于類腐殖質(zhì)類物質(zhì)。而當(dāng)系統(tǒng)發(fā)生了堵塞，DOM的組成基本不變，只是進(jìn)水中原本存在的類蛋白峰發(fā)生了微弱的紅移，有發(fā)生轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)，熒光峰的相對(duì)強(qiáng)度減弱，表明DOM的濃度減小。

(2)進(jìn)出水DOM主要成分為糖類、酚類、脂類、有機(jī)酸及芳香類有機(jī)物。堵塞的發(fā)生對(duì)去除有色DOM濃度是有利的，并且出水中大分子苯環(huán)結(jié)構(gòu)減少。

(3)反應(yīng)器發(fā)生堵塞時(shí)，下層土壤樣品微生物多樣性要大于上層，細(xì)菌的群落多樣性要大于真菌的群落多樣性。土壤樣品中綱一級(jí)的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為Actinobacteria放線菌綱和Alphaproteobacteria α-變形菌綱的菌群，主要優(yōu)勢(shì)真菌為Sordariomycetes糞殼菌綱和Eurotiomycetes散囊菌綱的菌群。