H2O2氧化-熒光分析法測定烏骨雞黑色素細胞中黑色素含量

陳露露，田穎剛,2*

1. 南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西 南昌 330047 2. 南昌大學生物質(zhì)轉(zhuǎn)化教育部工程研究中心，江西 南昌 330047

引 言

烏骨雞(black-bone silky fowl, BSF) 作為我國特有的藥食兩用的資源，具有補肝腎、益氣血, 尤其在增強體力、補血、治療糖尿病和婦科疾病等方面效果顯著[1]。與其他品種雞相比，較顯著差別在于烏骨雞體內(nèi)含有較多的黑色素?，F(xiàn)代科學研究已證實黑色素具有抗氧化、抗衰老、抗誘變等眾多生理功能[2]。

烏骨雞黑色素是由黑色素細胞生成，且廣泛分布于烏骨雞許多組織和器官表面，如皮膚、肌肉、心臟、腎臟、消化器官和骨骼等。本實驗室已建立了烏骨雞黑色素細胞的培養(yǎng)體系[3]，這對于烏骨雞黑色素的進一步研究具有重要意義。目前黑色素含量的測定方法有稱重法[4]、色差儀比色法[5]、紫外-可見分光光度法[6]和高效液相色譜法(HPLC)等[7]。前兩種方法可粗略地測定出黑色素含量，但在測定過程中可能會受到一些不溶于水的雜質(zhì)的干擾[8]。研究證實，紫外分光光度法有一定的不足之處： (1)假陽性： 黑色素在測量過程中會出現(xiàn)散射和假吸收。(2)高背景： 黑色素樣品中會有殘留的蛋白，這些蛋白會使背景偏高，導致測量值較大。高效液相色譜法(HPLC)也用于黑色素定量測量，該方法靈敏度高、準確，主要通過測定黑色素的氧化產(chǎn)物PDCA和PTCA的含量來間接換算成樣品中真黑色素的含量，但其操作復雜，成本較高[9-11]。

目前對于黑色素細胞中的黑色素含量的測定，主要采用NaOH裂解法[12-14]，該方法是將黑色素細胞在加熱的NaOH中裂解，再采用酶標儀在400 nm左右測定其吸光值來定量細胞中黑色素的含量。由于該方法與紫外分光光度法的原理相同，都是采用朗伯-比爾定律，因此也存在和紫外分光光度法相同的缺點和不足，因此建立一種測定細胞中黑色素的含量的新方法顯得至關重要。

熒光分析法是一種光學領域中用于熒光物質(zhì)分析的常用方法。與傳統(tǒng)方法相比，熒光檢測方法具有線性范圍寬、靈敏度高以及操作簡單等優(yōu)點。Fernandes等[10]證實黑色素在堿性過氧化氫溶液中的降解伴隨著強熒光的產(chǎn)生，并且可用于定量測定體外培養(yǎng)黑色素瘤細胞中的黑色素含量，且黑色素氧化后的熒光信號不受蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的影響，較吸收光譜法測定黑色素具有明顯的優(yōu)勢。目前，尚未采用熒光分析法測定烏骨雞黑色素細胞中含量。

本研究旨在建立一種熒光定量烏骨雞黑色素細胞中黑色素的新方法，并進行方法學驗證，這將為烏骨雞黑色素細胞中黑色素的生成機理以及調(diào)控的進一步研究奠定了基礎，也為測定其他更加復雜的生物組織中的黑色素含量提供了參考。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

烏骨雞苗(5日齡)由江西泰和提供。膠原酶Ⅰ(Sigma公司)，DMEM培養(yǎng)基(北京索萊寶公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(北京博大泰克生物基因技術有限公司)，乙二胺四乙酸(EDTA，Sigma 公司)，十四烷酰佛波醇乙酯(TPA，美國 Sigma公司)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，美國 Sigma公司)，過氧化氫(30%，50%)(分析純)(廣州西隴科學股份有限公司)，氫氧化鈉(分析純)(上海潤捷化學試劑有限公司)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

F-4500熒光分光光度計，日本日立公司； Varioskan Flash 4.00.53全波長掃描式多功能讀數(shù)儀，美國賽默飛世爾科技公司； INC153型細胞培養(yǎng)箱，德國memmert公司； DG5033A型酶標儀，南京華東電子集團醫(yī)療裝備有限責任公司； KQ-50超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司； Precisa XB220A電子天平，深圳市新朗普電子科技有限公司； 電熱恒溫水浴鍋HH-4，上海森信實驗儀器有限公司； 低速臺式離心機80-2B，上海安亭科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)

1.3.1.1 烏骨雞黑色素細胞培養(yǎng)

取烏骨雞雞苗，處死，3%Na2S脫毛，蒸餾水擦洗，浸沒于75%乙醇中。在超凈工作臺取皮膚組織，置于培養(yǎng)皿中，用PBS漂洗兩遍，并除去血塊和肌肉等雜質(zhì)。用0.25%氯霉素-青鏈霉素/PBS洗滌3次，每次5 min。PBS漂洗兩遍后加入0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol·L-1EDTA置于37℃水浴消化90 min，10% FBS/DMEM完全培養(yǎng)基終止反應。400目無菌篩網(wǎng)過濾消化液，1 500 r·min-1離心5 min后收集細胞，按1×106個·mL-1的細胞濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入10% FBS，10 ng·mL-1TPA，20 ng·mL-1bFGF，在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞融合至90%～100%后進行傳代。本文選用第3代進行后續(xù)實驗。

1.3.1.2 A375細胞的培養(yǎng)

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的A375細胞，按4×105細胞個數(shù)接種于無菌培養(yǎng)瓶中，加入含10% FBS的DMEM，置于37 ℃，5% CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.2 烏骨雞黑色素激發(fā)波長和發(fā)射波長的測定

制備烏骨雞精制黑色素(本研究以精制黑色素為黑色素標準品)[15]，取濃度為100 μg·mL-1的烏骨雞黑色素標準品0.5 mL于25 mL的錐形瓶中，加入終濃度為24%的過氧化氫溶液，使反應液體積達到2.5 mL，調(diào)節(jié)體系的pH值為8，避光，55 ℃孵育2 h，超聲10 min，用蒸餾水定容到5 mL，混勻，3 500 r·min-1離心5 min，取上清，利用F-4500熒光分光光度計，在狹縫寬度5 nm、掃描速度為2 400 nm·min-1以及掃描間距為1 nm條件下對反應液進行熒光掃描，確定其最佳激發(fā)波長和發(fā)射波長。

1.3.3 標準曲線制作

分別配制質(zhì)量濃度為10，20，40，60，80和100 μg·mL-1的烏骨雞黑色素標準溶液，各取0.5 mL于25 mL的錐形瓶中，按照1.3.2的反應條件，取上清于全黑酶標板中，使用全波長掃描式多功能讀數(shù)儀測定其相對熒光強度。

1.3.4 過氧化氫濃度對相對熒光強度的影響

取濃度為100 μg·mL-1的烏骨雞黑色素標準品0.5 mL，加入終濃度分別為6%，10%，14%，18%，22%，24%和26%的過氧化氫溶液，其余氧化條件同1.3.2，測定其相對熒光強度，確定最佳過氧化氫濃度。

1.3.5 氧化時間對相對熒光強度的影響

取濃度為10和100 μg·mL-1的烏骨雞黑色素標準品0.5 mL，加入終濃度為24%的過氧化氫溶液，分別孵育40，60，80，100，120和140 min，其余氧化條件同1.3.2，測定其相對熒光強度，確定最佳氧化時間。

1.3.6 pH值對相對熒光強度的影響

取濃度為10和100 μg·mL-1的烏骨雞黑色素標準品0.5 mL，加入終濃度為24%的過氧化氫溶液，調(diào)節(jié)體系的pH值分別為6，7，8，9和10，其余氧化條件同1.3.2，測定其相對熒光強度，選擇最佳pH值。

1.3.7 細胞中黑色素含量的測定

待細胞培養(yǎng)結束后，吸取細胞上清，PBS清洗1遍，加入0.5 mL 0.25%胰蛋白酶-0.53 mmol·L-1EDTA進行消化，含10% FBS的DMEM終止消化，收集細胞懸液，PBS清洗兩遍，1 500 r·min-1離心5 min，細胞沉淀中加入0.5 mL的0.15 mol·L-1NaOH，80 ℃超聲1 h，按照1.3.2的氧化條件進行反應，測定其相對熒光強度值。

1.3.8 方法檢出限的測定與計算

按照1.3.3的測定方法，測定10份空白樣品的相對熒光強度，采用紫外分光光度法[16]測定10份空白樣品的吸光值，按照式(1)計算方法檢出限[17-18]

Ck=3s/k

(1)

式中：Ck為方法檢出限；s為空白的標準偏差；k為標準曲線斜率。

1.3.9 統(tǒng)計學分析

所得數(shù)據(jù)和圖表的制作采用EXCEL(2019版)和Origin9.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件。數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差(x±s)表示，多個樣本之間比較用單因素的方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗，檢驗水準α=0.05，p<0.05表示有顯著性差異，p<0.01表示有極顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 烏骨雞黑色素細胞形態(tài)

如圖1所示，烏骨雞黑色素細胞如其他黑色素細胞一樣，胞內(nèi)充滿了黑色素顆粒，由于其生理狀態(tài)不同，細胞中的黑色素含量也不同。由圖可知，第1代黑色素細胞(a)中含有的黑色素含量顯著高于第2代黑色素細胞(b)。

圖1 烏骨雞原代黑色素細胞形態(tài)(a)： 第1代烏骨雞黑色素細胞； (b)： 第2代烏骨雞黑色素細胞Fig.1 Morphological of primary melanocytesof Black-bone silky fowl(a): The first generation of BSF melanocytes;(b): The second generation of BSF melanocytes

2.2 烏骨雞黑色素激發(fā)波長和發(fā)射波長

按照1.3.3測定方法，測定烏骨雞黑色素標準品以及烏骨雞黑色素細胞中黑色素的熒光光譜。由圖2和圖3可知，激發(fā)光均在354 nm的熒光強度最大，發(fā)射光均在453 nm的熒光強度最大，因此烏骨雞黑色素的激發(fā)波長為354 nm，發(fā)射波長為453 nm。

2.3 過氧化氫濃度對相對熒光強度的影響

如圖4(a)所示，當過氧化氫的濃度范圍在6%～24%之間時，相對熒光強度值隨著過氧化氫濃度的增大而增大，當濃度達到24%時，相對熒光強度值開始趨于平穩(wěn)，經(jīng)統(tǒng)計學分析，過氧化氫濃度在24%時的相對熒光強度值顯著高于22%(p<0.05)，與濃度為26%時的相對熒光強度無顯著差異，這表明過氧化氫最佳濃度范圍在24%～26%之間，本文選用24%為過氧化氫的工作濃度。

2.4 氧化時間對相對熒光強度的影響

當氧化時間在60～140 min的范圍內(nèi)，濃度為10和100 μg·mL-1的黑色素標準品的相對熒光強度如圖4(b)所示，當黑色素標準品濃度為10 μg·mL-1時，氧化不同時間后所測得的相對熒光強度之間無顯著差異，當黑色素標準品濃度為100 μg·mL-1時，相對熒光強度在120 min處最大，且顯著大于100 min處的相對熒光強度值(p<0.01)，因此最佳氧化時間為120 min。

圖2 烏骨雞黑色素標準品激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig.2 Excitation spectrum and emissionspectrum of the BSF standard

圖3 烏骨雞黑色素細胞中黑色素激發(fā)光譜和發(fā)射光譜Fig.3 Excitation spectrum and emission spectrumof melanin in BSF melanocyte

圖4 各因素對相對熒光強度的影響Fig.4 Effect of various factors on the relative fluorescence intensity

2.5 pH值對相對熒光強度的影響

如圖4(c)所示，黑色素標準品的濃度為10 μg·mL-1時，pH 8時的相對熒光強度顯著大于其他pH值的相對熒光強度(p<0.01); 當黑色素標準品的濃度為100 μg·mL-1，pH值為8時的相對熒光強度最大，與pH值為9時的相對熒光強度并無顯著性差異。綜上所述，黑色素的氧化反應的最佳pH值為8。

2.6 線性回歸分析及檢測限

按照1.3.2的方法，得回歸方程為b=0.014 7a+0.313 8(b為相對熒光強度，a為濃度)，r=0.997 4，線性范圍在10～100 μg·mL-1，相關系數(shù)為正數(shù)，說明相對熒光強度隨黑色素的含量增加而增加，并且它的絕對值接近1，成較好的正相關性。按照1.3.8的方法計算可得熒光分析法的方法檢出限為0.30 μg·mL-1，紫外分光光度法的方法檢出限為3.68 μg·mL-1，這表明熒光分析法的檢測限較低，更適用于細胞內(nèi)黑色素含量的測定。

2.7 精密度和重復性

精密量取細胞懸液，按照1.3.7的方法連續(xù)測定5次，其相對熒光強度值分別為0.93，0.97，0.96，0.97和0.95，RSD值為1.87%，表明儀器精密度良好。

精密量取3份相同的細胞懸液，按照1.3.7的方法分別測定，其相對熒光強度分別為0.93，1.00和0.93，RSD值為4.59%，表明其重復性較好。

2.8 加標回收實驗

精密量取15份的A375細胞懸液，分成三組，每組加入濃度分別為25，40和80 μg·mL-1的黑色素標準溶液，按照1.3.7的方法測定其黑色素含量，每個加標水平平行測定5次，如表1所示，測得的黑色素含量分別為24.30，41.41和80.17 μg·mL-1，則相對誤差分別為2.78%，3.53%和0.25%。

精密量取15份的黑色素細胞懸液，分成三組，每組分別加入質(zhì)量為5.00，7.50和10.00 μg的黑色素，按照1.3.7的方法測定其黑色素含量，每個加標水平平行測定5次，計算回收率和平均回收率，見表2，回收率在95.94%～99.83%之間，平均回收率95.57%，RSD值為4.00%，表明該方法較準確。

表1 加標回收實驗(人惡性黑色素瘤細胞)Table 1 Standard addition recovery experiment(A375)

表2 加標回收實驗(烏骨雞黑色素細胞)Table 2 Standard addition recovery experiment(the BSF melanocytes)

2.9 烏骨雞黑色細胞中黑色素含量的測定

按照1.3.7的方法測定不同代數(shù)的烏骨雞黑色素細胞中黑色素的含量如表3所示，第1、2代的烏骨雞黑色素細胞中的黑色素含量分別為7.06 μg/104個細胞、3.36 μg/104個細胞。這表明在體外培養(yǎng)的烏骨雞黑色素細胞中，細胞中黑色素含量隨著代數(shù)的升高有下降的趨勢。

表3 烏骨雞黑色素細胞中黑色素含量的測定Table 3 Determination of melanin contentin BSF melanocytes

采用NaOH裂解法測定細胞中的黑色素含量時，一些雜質(zhì)與蛋白也會溶于NaOH中產(chǎn)生一定的吸收從而影響定量結果，使結果偏大[19]。本研究通過在A375細胞(無黑色素的人的黑色素瘤細胞)中添加不同濃度的黑色素標準品(25，40和80 μg·mL-1)，結果顯示，測定值與理論值的相對誤差分別為2.78%，3.53%和0.25%。這表明A375細胞中的其他雜蛋白以及脂質(zhì)不會對黑色素氧化后產(chǎn)生的熒光有貢獻。有研究已經(jīng)證實，采用熒光分析法測定黑色素時，其他雜蛋白以及脂質(zhì)對測定結果并無干擾[20]。為了進一步證實該方法的準確性，在烏骨雞黑色素細胞中也分別添加了不同質(zhì)量的烏骨雞黑色素標準溶液，所得的回收率在92.14%～99.83%之間，平均回收率為95.97%，RSD值為4.00%，回收率較高，這表明該方法較準確可靠。黑色素溶解性較差，采用紫外分光光度法測定細胞中黑色素色的前提條件是黑色素需要完全溶解在堿液中，而熒光分析法在樣品前處理過程中只需黑色素混懸在堿液中，簡化了分析操作過程。并且通過比較可知，熒光分析法的方法檢測限比紫外分光光度法低至少10倍。

綜上所述，熒光分析法是一種簡單、準確、檢測限低，靈敏度較高的細胞中黑色素含量的測定方法，該方法的建立將為烏骨雞黑色素細胞中黑色素的生成機理以及調(diào)控的進一步研究奠定了基礎，也為測定其他更加復雜的生物組織中的黑色素含量提供了參考。烏骨雞黑色素氧化后熒光發(fā)射基團結構及熒光生成機理還有待于進一步研究。

3 結 論

建立了熒光定量烏骨雞黑色素細胞中黑色素的新方法，通過篩選得出烏骨雞黑色素在10～100 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)的最佳氧化條件： pH值為8，氧化溫度為55 ℃，過氧化氫濃度在24%～26%之間，氧化時間為2 h。該方法穩(wěn)定、可靠，儀器精密度較高，重復性較好，且加標回收率較高，測定結果不受細胞中的雜蛋白以及脂質(zhì)的影響，且準確可靠，成本較低、靈敏度高、檢測限比紫外分光光度法低至少10倍、儀器操作簡單，能夠較好地應用于烏骨雞黑色素細胞中黑色素含量的測定。該方法的首次建立將為烏骨雞黑色素細胞中黑色素合成過程的調(diào)控以及烏骨雞黑色素的深入開發(fā)利用奠定了堅實的基礎，也為測定其他更加復雜的生物組織中的黑色素含量提供了參考。