非小細(xì)胞肺癌患者血清外泌體中表皮生長因子受體的表達(dá)情況及其對NCI-H1299細(xì)胞增殖和侵襲的影響▲

路 通 鄒志田 裴艷志 喬 峰 朱曉峰

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科，黑龍江省佳木斯市 154002，電子郵箱：jnlutong0227@163.com)

非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是發(fā)病率和致死率較高的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，大部分NSCLC患者確診時已處于中晚期，常伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，5年生存率極低[1-3]。近年來研究證實(shí)，外泌體中的非編碼RNA或蛋白可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為，進(jìn)而介導(dǎo)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[4-5]。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在多種惡性腫瘤組織和細(xì)胞系中異常高表達(dá)，包括乳腺癌[6]、胃癌[7]、結(jié)直腸癌[8]、肺癌[9]和肝癌[10]等。Zhang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌細(xì)胞外泌體中EGFR呈高表達(dá)，且胃癌細(xì)胞外泌體中EGFR過表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。因此，本研究探討血清外泌體EGFR與NSCLC發(fā)生和發(fā)展的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本及血標(biāo)本來源 收集2012年1月至2017年12月就診于佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院的10例NSCLC患者術(shù)前的血清標(biāo)本(NSCLC組)，患者確診后均未行任何治療，其中男性6例，女性4例，年齡(62.62±8.92)歲；并收集15例NSCLC患者(含上述已收集血清標(biāo)本的10例患者)手術(shù)切除的癌組織和距離癌組織3 cm的癌旁組織。所有NSCLC患者均經(jīng)影像學(xué)和病理學(xué)資料證實(shí)為原發(fā)NSCLC。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前已經(jīng)進(jìn)行放療或化療的患者；(2)不同意參與本研究的患者；(3)不能耐受手術(shù)的患者；(4)合并有免疫系統(tǒng)疾病的患者。并收集同期8例健康體檢者的血清標(biāo)本(正常組)，研究對象均無NSCLC及其他疾病，其中男性4例，女性4例，年齡(60.52±9.06)歲。NSCLC組和正常組研究對象的年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。所有研究對象對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑 杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；批號：01-055-9A)和胎牛血清(批號：04-011-1A)購自美國Biological Industries公司；青霉素和鏈霉素混合液購自北京雷根生物技術(shù)有限公司(批號：CA0075)；細(xì)胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8，CCK-8)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司(批號：CSB-E08986h)；Transwell小室購自美國康寧公司(批號：CLS3396)；TRIzol試劑盒(批號：9108)和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM(批號：RR037A)購自日本TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒(批號：1632086)和十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)快速制備試劑盒(批號：1610306)購自美國Bio-Rad公司；免疫印跡一抗[抗EGFR抗體(批號：4267)、抗CD63抗體(批號：40623S)、抗CD9抗體(批號：13403)、抗白蛋白抗體(批號：4929)和抗鈣連蛋白抗體(批號：2433)]和二抗[羊抗兔IgG(H+L)，批號：14709)]均購于購自美國CST公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司(批號：QP007)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) NSCLC細(xì)胞NCI-H1299購自北納生物(貨號：BNCC100268)，采用含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL和鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.4 血清外泌體的分離 取1 mL血清標(biāo)本和9 mL磷酸緩沖鹽溶液(phosphate-buffered saline，PBS)混合于10 mL離心管中，于4℃、3 653 r/min離心10 min(留取外周血單個核細(xì)胞)，再經(jīng)0.45 μM無菌濾膜過濾到10 mL的超濾離心管后，再經(jīng)3 653 r/min離心20 min去除結(jié)晶、細(xì)胞和細(xì)胞碎片；隨后小心地將上清液轉(zhuǎn)移到超速離心管中，于14 704 r/min離心40 min去除大囊泡；留取上清液，于4℃、44 519 r/min離心2 h，留取上清液作為無外泌體血漿，再使用9 mL PBS重懸外泌體，并采用0.22 μm濾膜過濾并轉(zhuǎn)移到干凈的超速離心管中，然后于4℃、44 519 r/min再次離心1 h，棄上清液；將所獲得的沉淀(即為外泌體)用500 μL PBS重懸，置于1.5 mL EP管內(nèi)，置于-80℃冰箱備用。

1.5 血清外泌體的鑒定 (1)參考文獻(xiàn)[12]的方法，將分離獲得的新鮮外泌體溶液20 μL，采用20 μL PBS稀釋后滴加到銅網(wǎng)上，室溫干燥15 min。PBS清洗銅網(wǎng)3次，加入1%戊二醛固定5 min；蒸餾水沖洗后采用0.4%醋酸雙氧鈾染色5 min；采用甲基纖維素和醋酸雙氧鈾的混合物再次染色并包被外泌體樣品10 min，室溫晾干10 min后采用Tecnai G2 Spirit TWIN透射電鏡(美國FEI公司)觀察并拍照。(2)采用免疫印跡試驗(yàn)檢測外泌體標(biāo)志蛋白(CD9或CD63)、鈣連蛋白和白蛋白。

1.6 相關(guān)指標(biāo)的檢測方法

1.6.1 免疫印跡試驗(yàn)：取分離獲得的新鮮外泌體20 μL，加入10 μL蛋白裂解液(美國賽默飛世爾公司，批號：89900)于冰上裂解30 min，于4℃、13 423 r/min離心15 min，收集上清。采用二喹啉甲酸法檢測樣本中蛋白總濃度，計算上樣濃度。經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，清洗后加入一抗[EGFR(1 ∶1 000)、CD63(1 ∶1 000)、CD9(1 ∶1 000)、白蛋白(1 ∶1 000)和鈣連蛋白(1 ∶1 000)]，4℃孵育10 h后加入二抗(1 ∶500)雜交。化學(xué)發(fā)光儀(美國Bio-Rad公司，型號：170-8265)成像，并用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量。同法檢測無外泌體血漿及外周血單個核細(xì)胞中的相關(guān)蛋白。

1.6.2 實(shí)時定量PCR檢測NSCLC組織和癌旁組織EGFR mRNA表達(dá)水平：采用TRIzol試劑盒提取組織中的總RNA，首先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系包括10×擴(kuò)增緩沖液 10 μL，4種dNTP混合物各200 μmol/L，引物各10～100 pmol，模板DNA 0.1～2 μg，Taq DNA聚合酶2.5 U，鎂離子1.5 mmol/L，加三蒸水至100 μL。擴(kuò)增反應(yīng)為95℃ 5 min預(yù)變性；95℃ 10 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算EGFR mRNA的相對表達(dá)水平。所使用引物序列見下表1。

表1 PCR引物序列

1.6.3 CCK-8法檢測NCI-H1299細(xì)胞增殖情況：將對數(shù)生長期的NCI-H1299細(xì)胞接種于96孔板中，密度為1×104個/mL。分為NSCLC組、正常組、對照組，每組設(shè)置5個復(fù)孔。待細(xì)胞完全貼壁后，采用PBS清洗，并加入100 μL DMEM培養(yǎng)液，然后NSCLC組、正常組分別加入10 μL NSCLC患者血清外泌體懸液或正常健康人外泌體懸液，對照組加入等體積的PBS。分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h，并于相應(yīng)時間點(diǎn)分別加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，用酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司，型號：ELX800)檢測450 nm處吸光值。每組樣品做3次重復(fù)。

1.6.4 Transwell法檢測NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力：將對數(shù)期NCI-H1299細(xì)胞分為NSCLC組、正常組和對照組，用胰酶消化處理后，接種于Transwell小室24孔板內(nèi)，上室加100 μL(細(xì)胞密度為2×105個/mL)細(xì)胞懸液，下室加500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，隨后NSCLC組、正常組分別在上室中加入100 μL無血清的DMEM培養(yǎng)基重懸的NSCLC患者血清外泌體懸液、正常健康人外泌體懸液，對照組加入等體積的無血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后取出小室，棉簽擦去微孔膜上室的細(xì)胞，PBS沖洗小室上下面各兩遍，4%的多聚甲醛固定侵襲并黏附到小室微孔膜下面的細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色15 min，PBS沖洗小室，干燥后置于40倍的雙目倒置顯微鏡(上海光學(xué)儀器廠，型號：XSP-80A)觀察視野下的細(xì)胞數(shù)目，以穿膜細(xì)胞數(shù)評估細(xì)胞的侵襲能力。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。采用Pearson檢驗(yàn)行相關(guān)性分析。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計后采用GraphPad Prism 7進(jìn)行圖片繪制。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血清外泌體的獲取與鑒定 在透射電子顯微鏡下可見，分離得到的血清中外泌體形態(tài)呈圓形或橢圓形(圖1)，且血清中多數(shù)外泌體粒徑在50～130 nm之間(圖2)。免疫印跡試驗(yàn)檢測結(jié)果顯示，外泌體標(biāo)志蛋白(CD9和CD63)在“無外泌體血漿”中有輕微條帶，在分離得到的外泌體中高表達(dá)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源的鈣連蛋白未在外泌體中檢出，這說明這些囊泡并非來源于細(xì)胞碎片；白蛋白主要在“無外泌體血漿”中大量檢出，同時外泌體標(biāo)本也有弱條帶(圖3)。以上結(jié)果提示，分泌得到的沉淀是血清中的外泌體。

圖1 透射電鏡下血清外泌體的形態(tài)圖2 血清外泌體粒徑大小圖3 外泌體相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.2 血清外泌體中EGFR蛋白表達(dá)情況 NSCLC組血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達(dá)水平為329 197.52±45 220.35，高于正常組的161 446.82±22 173.33(t=3.331，P=0.040)，見圖4。

圖4 NSCLC患者與健康體檢者血清外泌體中EGFR蛋白的表達(dá)水平比較

2.3 NSCLC組織中EGFR mRNA表達(dá)水平及其與血

清外泌體中EGFR蛋白表達(dá)水平相關(guān)性 NSCLC組織中EGFR mRNA相對表達(dá)水平為5.66±2.46，高于癌旁組織的3.48±2.22(t=2.550，P=0.008)。Pearson相關(guān)性分析顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達(dá)水平與NSCLC組織中的EGFR mRNA相對表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=0.821，P<0.001)。

2.4 3組NCI-H1299細(xì)胞增殖情況比較 培養(yǎng)24 h時，3組NCI-H1299細(xì)胞增殖活力比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而在培養(yǎng)48 h、72 h、96 h時，NSCLC組NCI-H1299細(xì)胞增殖活力高于正常組與對照組(均P<0.05)，而正常組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 3組NCI-H1299細(xì)胞增殖情況的比較(x±s)

注：與正常組、對照組比較，*P<0.05。

2.5 3組NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力比較 NSCLC組NCI-H1299穿膜細(xì)胞數(shù)量為(750.21±35.15)個，對照組為(409.52±25.01)個，正常組為(450.04±22.04)個，NSCLC組的NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力高于對照組和正常組(均P<0.05)，而對照組和正常組的NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖5。

圖5 3組對NCI-H1299細(xì)胞侵襲能力比較

3 討 論

隨著醫(yī)療水平的提高和科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的疾病得以治愈，然而目前仍然沒有合理的手段治療腫瘤。NSCLC具有發(fā)病率高、預(yù)后差、致死率高等特點(diǎn)，目前只有10%～15%的NSCLC患者可在早期確診后5年內(nèi)存活，因此NSCLC被公認(rèn)為對健康危害性最高的惡性腫瘤之一[13-14]。由于NSCLC早期癥狀并無特異性，大多數(shù)NSCLC患者被確診時已處于中晚期，多伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，尋找非侵入性且具有高靈敏度、特異性的分子標(biāo)志物，是NSCLC臨床上迫切需要亟待解決的問題。

外泌體是一種粒徑為40～150 nm的細(xì)胞外小囊泡，其含有多種成分，包括遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等[15-16]。不同來源的外泌體通過細(xì)胞間的傳導(dǎo)、組織間的浸潤以及抗原呈遞等方式，在多種疾病的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[17]。作為有效的信號分子，腫瘤細(xì)胞來源的外泌體在腫瘤細(xì)胞和構(gòu)成腫瘤微環(huán)境的周圍細(xì)胞之間發(fā)揮作用，腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞分泌的外泌體參與了腫瘤進(jìn)程的各個階段，并在抗腫瘤治療中發(fā)揮重要作用[18]。外泌體通過與基底細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，促進(jìn)血管的生成和血管表皮生長因子的高表達(dá)，從而加速腫瘤的發(fā)展[19-20]。因此，外泌體中的蛋白質(zhì)可作為惡性腫瘤的早期診斷分子標(biāo)志物[21]。Wang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者血清外泌體中CD82明顯低于健康者，且CD82可作為乳腺癌精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)診斷的生物標(biāo)志物。Kimura等[23]的研究表明，外泌體蛋白CKAP4可作為胰腺癌治療的分子標(biāo)志物。Pan等[24]的研究證實(shí)，來源于NSCLC細(xì)胞外泌體中蛋白MUC1高表達(dá)，具有作為NSCLC早期診斷的分子標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白表達(dá)水平高于正常健康人(P<0.05)，提示EGFR蛋白在NSCLC外泌體中高表達(dá)，其或可作為腫瘤早期診斷的標(biāo)志物。

EGFR是一種具有酪氨酸激酶活性的膜表面蛋白，一旦與表皮生長因子結(jié)合可啟動細(xì)胞核內(nèi)的有關(guān)基因，從而促進(jìn)細(xì)胞分裂增殖。EGFR高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、血管生成、侵襲、遷移和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、放化療耐受性以及術(shù)后預(yù)后密切相關(guān)[25-26]。靶向抑制EGFR不僅會抑制腫瘤細(xì)胞增殖活力，還能夠調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而抑制腫瘤發(fā)展進(jìn)程[11,27]。張自森等[28]發(fā)現(xiàn)，抑制EGFR可明顯下調(diào)胃癌AGS細(xì)胞惡性生物學(xué)行為，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療的敏感性。林珊等[29]研究證實(shí)，EGFR靶向抑制劑聯(lián)合放療可顯著抑制NSCLC細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對放療的敏感性。黃邵洪等[30]的研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌含EGFR外泌體可誘導(dǎo)免疫耐受細(xì)胞產(chǎn)生，從而抑制腫瘤特異性CD8+T淋巴細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，NSCLC患者血清外泌體中的EGFR蛋白相對表達(dá)量與NSCLC組織的EGFR mRNA相對表達(dá)量呈正相關(guān)(P<0.05)，NSCLC組NCI-H1299細(xì)胞增殖活力和侵襲能力明顯高于正常組與對照組(均P<0.05)，說明NSCLC患者血清外泌體中含有的EGFR表達(dá)量與腫瘤組織中的表達(dá)量具有一致性，且血清中所含EGFR的外泌體可促進(jìn)NCI-H1299細(xì)胞的增殖和侵襲能力。

綜上所述， NSCLC患者血清外泌體中EGFR蛋白表達(dá)水平升高，并與腫瘤組織中的EGFR mRNA表達(dá)一致，而且NSCLC患者血清外泌體可促進(jìn)NCI-H1299細(xì)胞增殖和侵襲能力。這或?yàn)檠逋饷隗wEGFR用于NSCLC的早期診斷以及預(yù)后評估提供理論基礎(chǔ)。