發(fā)芽粟米對高血脂癥小鼠血脂調(diào)節(jié)和抗氧化作用的研究

張佳麗 張愛霞 趙 巍 李少輝 劉瑩瑩 劉敬科 郝慶紅 陳秀勇

(河北省農(nóng)林科學(xué)院谷子研究所；國家谷子改良中心；河北省雜糧研究實(shí)驗(yàn)室1，石家莊 050035) (河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院2，保定 071001) (遵化市工業(yè)和信息化局3，唐山 064200)

郝慶紅，男，1979年出生，副教授，食品功能性研究

谷子[Setariaitalica(L.)P.Beauv.]，為禾本科狗尾草屬農(nóng)作物，具有生育期短、耐旱和耐貧瘠等優(yōu)勢，是北方地區(qū)廣泛種植的作物[1]。粟米為谷子脫殼后產(chǎn)物[2]，其最大程度地保留胚芽及皮層的營養(yǎng)價值，但因外層的纖維素及其復(fù)合物難以咀嚼，不容易被人體消化，使得粟米的使用受到限制。發(fā)芽技術(shù)能有效改善谷物的使用品質(zhì)和功能性質(zhì)[3-5]，更易被人體消化吸收，易開發(fā)功能型食品。谷物發(fā)芽過程中，生物酶被激活和釋放，部分蛋白質(zhì)、淀粉、脂酸等被酶降解[6]，產(chǎn)生并增加大量具有生理功能的活性物質(zhì)。

隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，高血脂癥患者逐年增加，發(fā)病率達(dá)21.4%，同時高血脂癥還可導(dǎo)致高血壓、糖尿病、脂肪肝、肝癌等疾病[7, 8]，嚴(yán)重危害人體健康。谷物發(fā)芽后具有降血脂的功能，目前已有報道，糙米發(fā)芽后，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid, GABA)和膳食纖維等含量增加，具有降血脂、降血壓、抗氧化等生理功能[9, 10]；薏米發(fā)芽后，提高了對高脂血脂小鼠降血脂和抗氧化作用[11]；燕麥發(fā)芽后，多酚含量增加，抗氧化活性增強(qiáng)[12]。目前對于發(fā)芽粟米的研究，主要集中在對活性成分GABA[13]和多酚[14]的提取與富集，而對其調(diào)節(jié)血脂和抗氧化性功能驗(yàn)證鮮有報道，導(dǎo)致市場對發(fā)芽粟米的認(rèn)識不足，產(chǎn)品開發(fā)較少，未能發(fā)揮發(fā)芽粟米營養(yǎng)功能。

本實(shí)驗(yàn)以發(fā)芽粟米為研究對象，考察了發(fā)芽粟米對高血脂癥小鼠血脂的調(diào)節(jié)作用和抗氧化功效，對明確發(fā)芽粟米的功能作用，開發(fā)發(fā)芽粟米功能型產(chǎn)品提供一定的參考。同時開發(fā)和利用發(fā)芽粟米可以改善人類主食結(jié)構(gòu)、提高人們健康水平，促進(jìn)粟米及其制品的生產(chǎn)和發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

1.1.1 動物

SPF級昆明小鼠60只，雄性，4周齡，體重(20±2) g，動物合格證號為No.1103241911015151，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號SCXK(京)2016-0002、基礎(chǔ)飼料。

1.1.2 材料與試劑

發(fā)芽粟米：實(shí)驗(yàn)室研制、TG試劑盒、TC試劑盒、LDL-C試劑盒、HDL-C試劑盒、MDA試劑盒、GSH試劑盒、CAT試劑盒、SOD試劑盒、GSH-Px試劑盒、豬油、膽固醇、丙硫氧嘧啶、去氧膽酸鈉、吐溫-80、丙二醇。

1.2 儀器與設(shè)備

SY88-TH礱谷機(jī)；IKA MF10粉碎機(jī)； Scientz-207A均質(zhì)機(jī)；Avanti J-301高速離心機(jī)；HWS28型電熱恒溫水浴鍋；DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽粟米制備方法

谷子(冀谷19號)，經(jīng)曬干(水分含量低于10%)脫殼后為粟米。將篩選過的粟米用蒸餾水清洗，10%次氯酸鈉溶液殺菌5 min，再用0.5%的氯化鈣溶液浸泡12 h，將浸泡后的粟米放置于墊有紗布的平皿上，發(fā)芽24 h，發(fā)芽結(jié)束后，置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎過100目篩，備用。

1.3.2 高脂乳劑的制備方法

稱取豬油20 g，80 ℃水浴融化，倒入研缽中。向研缽中加入膽固醇10 g，丙硫氧嘧啶1 g，充分研磨溶解混勻。分別加入吐溫- 80和丙二醇各20 mL，充分研磨混勻，再邊研磨邊加入20 mL 10%去氧膽酸鈉水溶液，充分研磨至乳化，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，蒸餾水定容，密封，冷藏，備用。每次使用前于80 ℃水浴融化。

1.3.3 發(fā)芽粟米主要活性成分檢測方法

維生素B6：GB 5009.154—2016；

L(+)-抗壞血酸：GB 5009.86—2016；

葉酸： GB 5413.16—2010；

GABA：根據(jù)段智紅等[15]實(shí)驗(yàn)方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取1 g粟米粉于10 mL離心管中，加入5 mL水進(jìn)行振搖處理2 h，離心(4 000 r/min，10 min)，收集上清液，按著上述步驟重復(fù)提取1次，合并上清液。取上清液1 mL進(jìn)行衍生化，后進(jìn)行HPLC分析。

總黃酮：根據(jù)楊芙蓮等[16]實(shí)驗(yàn)方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g粟米粉，利用3 mL純甲醇超聲提取90 min(分三次提取，每次超聲30 min)，10 000 g離心3 min，收集上清液，備用。

取提取液1 mL，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉，靜置5 min，加入 0.5 mL 10%硝酸鋁，靜置5 min，加入2 mL 4% NaOH，搖勻，15 min后測定510 nm處吸光值，利用蘆丁制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總酚：根據(jù)徐磊[11]實(shí)驗(yàn)方法，并稍作修改。準(zhǔn)確稱取0.5 g粟米粉，利用3 mL 純甲醇超聲提取90 min(分三次提取，每次超聲30 min)，10 000 g離心3 min，收集上清液，備用。

取提取液200 μL，置于5 mL試管中，依次加入2 mL 蒸餾水，400 μL 20%碳酸鈉，400 μL 福林酚試劑，充分混勻，室溫避光靜置120 min，在波長760 nm處測吸光值。用沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 動物分組及模型的建立

60只實(shí)驗(yàn)小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白對照組、高脂模型組、低劑量組、中劑量組和高劑量組共5組，每組12只。第2周開始，每天早上，高脂模型組、低、中、高劑量給小鼠灌胃高脂乳劑，空白對照組給小鼠灌胃相應(yīng)量的生理鹽水。因小鼠存在個體差異，故其余時間小鼠自由飲水進(jìn)食，每組小鼠飼喂飼料為平均5 g/只。實(shí)驗(yàn)共6周，2 d換一次墊料，每周稱一次體重[17]，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案

1.3.5 體重和肝重比的測定

體重增重率=(終體重-初體重)/初體重×100%

肝重比(g/100 g)=肝臟重量(g)/體質(zhì)量(g)×100

1.3.6 血清的制備

實(shí)驗(yàn)周期5周，定期稱體重。實(shí)驗(yàn)終期，禁食不禁水12 h，稱體重并記錄，眼球取血法取血，3 000 r/min離心15 min，分離血清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.7 肝組織勻漿制備

頸椎脫臼法處死小鼠，分離肝臟，預(yù)冷生理鹽水沖洗后吸干水分，稱取質(zhì)量，計(jì)算肝臟指數(shù)。剪取0.3 g肝組織置于均漿管中，再向其中加入2.7 mL 4 ℃的生理鹽水，均漿，制備10%勻漿。將10%勻漿用離心機(jī)3 500 r/min條件下離心10 min，取上清液分裝，貯存于-80 ℃冰箱備用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)”表示。組間做t檢驗(yàn)，P<0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)芽粟米主要活性成分

由表1可知，在發(fā)芽粟米中檢測到具有生理活性成分的化合物，如GABA、總黃酮和總酚等。維生素B6、L(+)-抗壞血酸和葉酸都具有抗氧化的生理活性作用；GABA具有抑制中樞神經(jīng)、增加腦供血液流量、降血脂、降血壓和防止肥胖等生理活性作用[15, 18]；酚類化合物具有抗氧化、護(hù)肝、降膽固醇、抑菌等作用[19]；黃酮類化合物是酚類化合物的一個分類，具有抗氧化、保護(hù)肝臟、改善心腦血管循環(huán)、保護(hù)心臟、抑制癌細(xì)胞生長等作用[20, 21]。

表2 發(fā)芽粟米主要活性成分含量

2.2 發(fā)芽粟米對小鼠體重和肝重比的影響

發(fā)芽粟米能夠降低高血脂癥小鼠體重的增長率。由圖1可知，與空白對照組相比，高脂模型組的體重和肝臟指數(shù)均顯著升高(P<0.05)，可見長期的高脂飲食可影響體重和肝重比的變化。與高脂模型組相比，發(fā)芽粟米各劑量組喂養(yǎng)小鼠的體重增長率和肝重比顯著降低，其中低劑量組體重增長率已經(jīng)較高脂模型組降低了約1/5，說明發(fā)芽粟米對于小鼠體重的增長有明顯的抑制作用。相同的結(jié)論在其他發(fā)芽谷物中也有報道，如文瓊[22]在發(fā)芽糙米控制小鼠體重的實(shí)驗(yàn)中同樣發(fā)現(xiàn)低劑量組(12.5%發(fā)芽糙米)的體重增長率也有了顯著的降低。這可能是由于發(fā)芽粟米中膳食纖維和GABA有關(guān)，膳食纖維遇水膨脹，飼喂小鼠的過程中，膳食纖維能讓小鼠容易產(chǎn)生飽腹感，導(dǎo)致進(jìn)食量減少[8]；GABA能夠調(diào)節(jié)小鼠胃腸道激素的分泌，控制下丘腦的飽中樞，調(diào)節(jié)食欲，降低小鼠體重[23]。

高脂模型組小鼠的肝重比達(dá)到(4.89±0.44) g/100 g，是飼喂發(fā)芽粟米組的肝臟指數(shù)的1.1～1.2倍，說明發(fā)芽粟米對于小鼠肝臟重量的增長有一定的抑制作用。這一結(jié)果與其他發(fā)芽谷物飼喂小鼠的結(jié)果相似，如徐磊[11]利用發(fā)芽薏米飼喂小鼠發(fā)現(xiàn)肝臟增長率降低。本研究利用發(fā)芽粟米飼喂小鼠，使得肝重比降低，可能原因是由于一些發(fā)芽過程中內(nèi)含成分的增加導(dǎo)致的。如Sharma等[24]的文獻(xiàn)報道，谷物發(fā)芽后黃酮類化合物有了明顯的增長，而黃酮類化合物有抑制脂肪肝的作用。

圖1 發(fā)芽粟米對小鼠體重的影響(X ± SD, n=12)

表3 發(fā)芽粟米對小鼠肝重比的影響

分組肝臟指數(shù)/g/100 g空白對照組4.53±0.52高脂模型組4.89±0.44a低劑量組3.90±0.34b中劑量組4.31±0.35b高劑量組3.80±0.36b

注：“a”：高脂模型組與空白對照組相比較P<0.05；“b”：各劑量組與高脂模型組相比較P<0.05；數(shù)據(jù)中沒有字母表示無顯著差異P>0.05。

2.3 發(fā)芽粟米對小鼠血清和肝臟血脂指標(biāo)的影響

發(fā)芽粟米能夠降低小鼠血清和肝臟中的TC、TG、LDL-C，升高血清中HDL-C水平。由表4和表5可知，與空白對照組相比，高脂模型組小鼠血清和肝臟中TC、TG和LDL-C顯著升高(P<0.05)，HDL-C水平顯著降低(P<0.05)，說明高脂模型組造模成功。與高脂模型組相比，發(fā)芽粟米各劑量組均能降低小鼠血清和肝臟中的TC、TG和LDL-C的水平和升高HDL-C(P<0.05)的水平。在血清中，高劑量組效果最為明顯，高劑量組對TC、TG、LDL-C分別下降39.40%、31.67%、51.89%，對HDL-C升高36.80%。在肝臟中，中劑量組效果最為顯著，降低率TC、TG、LDL-C分別為58.75%、15.38%、40.81%，升高率HDL-C為50.00%。

表4 發(fā)芽粟米對小鼠血清中血脂水平的影響

注：“a”：高脂模型組與空白對照組相比較P<0.05；“b”：各劑量組與高脂模型組相比較P<0.05，數(shù)據(jù)中沒有字母表示無顯著差異P> 0.05。

表5 發(fā)芽粟米對小鼠肝臟中血脂水平的影響

注：“a”：高脂模型組與空白對照組相比較P<0.05；“b”：各劑量組與高脂模型組相比較P<0.05，數(shù)據(jù)中沒有字母表示無顯著差異P>0.05。

高血脂癥是指機(jī)體脂類代謝異常引起血中TC、TG和LDL-C過高，HDL-C偏低的一種疾病[25]。LDL-C作用是將肝臟合成的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到全身組織；HDL-C作用是運(yùn)送周圍組織和動脈壁上的膽固醇到肝臟中進(jìn)行分解，通過膽汁排出體外，起到疏通血管的作用[26]。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽粟米可以降低血漿中TC、TG和LDL-C水平，升高HDL-C水平。文瓊和Imam等[22, 27]利用發(fā)芽糙米飼喂小鼠也到了相似的研究結(jié)果，說明發(fā)芽谷物能夠降低小鼠血脂。本文研究結(jié)果可能是由于發(fā)芽粟米中含有GABA和膳食纖維等生物活性物質(zhì)對血脂起到調(diào)節(jié)作用。GABA通過抑制谷氨酸脫羧反應(yīng)，使血液中的氨基酸含量降低，解除氨毒，具有活化肝臟的作用，加快膽固醇在機(jī)體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和分解，改善脂質(zhì)在體內(nèi)代謝[28, 29]。膳食纖維可減少機(jī)體對膽固醇和脂肪酸吸收、干擾膽汁代謝、改變肝臟脂質(zhì)代謝，達(dá)到降低血脂的目的[30]。發(fā)芽粟米有效緩解了小鼠體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，抑制脂質(zhì)在血管壁和肝臟中的沉積，改善脂質(zhì)在體內(nèi)的代謝。

2.4 發(fā)芽粟米對小鼠血清和肝臟抗氧化指標(biāo)的影響

發(fā)芽粟米飼喂小鼠具有明顯的抗氧化功能。由表6和表7可知，與空白對照組相比，高脂模型組血清和肝臟中MDA的含量顯著升高(P<0.01或P<0.05)，SOD、GSH-Px、CAT的活力和GSH的含量顯著降低(P<0.01或P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明高脂飼料促使大鼠體內(nèi)發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。血清中，與高脂模型組相比，發(fā)芽粟米各劑量組MDA含量顯著降低(P<0.05或P<0.01)，SOD、GSH-PX、CAT的活力和GSH的含量顯著升高(P<0.05或P<0.01)，并且高劑量組的效果最明顯。在肝臟中，與高脂模型組相比，中、高劑量組MDA的含量極顯著降低(P<0.01)，SOD、GSH-PX、CAT的活力顯著升高(P<0.01或P<0.05)，GSH的含量顯著升高(P<0.05)。由此可見，發(fā)芽粟米對小鼠血清和肝臟內(nèi)的脂質(zhì)過氧化有一定的調(diào)節(jié)作用。

表6 發(fā)芽粟米對小鼠血清中抗氧化指標(biāo)的影響

注：與空白對照組相對比a:P<0.01，b:P<0.05；與高脂模型組相對比c:P<0.01，d:P<0.05；數(shù)據(jù)中沒有字母表示無顯著差異P>0.05，余同。

表7 發(fā)芽粟米對小鼠肝臟中抗氧化指標(biāo)的影響

高血脂癥可造成機(jī)體脂質(zhì)代謝紊亂，引起機(jī)體氧自由基產(chǎn)生增加而自由基相關(guān)清除酶活力下降[26]。MDA 是脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物，干擾脂肪酸的氧化降解，其含量與生物體內(nèi)過氧化的程度呈相關(guān)，MDA含量增加可損傷肝臟[31]；SOD、GSH-Px、CAT是體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激酶，可轉(zhuǎn)化自由基為氧化氫，減少脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生[32]；GSH是體內(nèi)抗氧化劑，可清除體內(nèi)自由基和調(diào)節(jié)物質(zhì)作用。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高血脂癥小鼠的MDA含量顯著升高、SOD、GSH-Px、CAT的活力顯著降低和GSH的含量顯著降低，結(jié)果表明高血脂癥小鼠體內(nèi)抗氧化能力下降，機(jī)體有脂質(zhì)過氧化損傷。用發(fā)芽粟米飼喂后，降低了高脂血癥小鼠血清和肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，增強(qiáng)抗氧化酶SOD、GSH-Px、CAT的活力和升高抗氧化劑GSH的含量。這與劉雅晴等[33]研究結(jié)果相似，糙米在經(jīng)過發(fā)芽后，可提高大鼠肝臟組織勻漿中總抗氧化能力(Total antioxidant caPacity, T-AOC)、總超氧化物歧化酶(Total suPeroxide dismutase, T-SOD)的活力，減少肝臟中MDA的生成，抗氧化活性有所增強(qiáng)，對肝臟起到保護(hù)作用，此研究結(jié)果可能與發(fā)芽糙米中含有γ-谷維素、維生素E、多酚等生物活性物質(zhì)有關(guān)[34-37]。

本研究結(jié)果， 可能與發(fā)芽粟米中含有維生素B6、黃酮類化合物和酚類化合物等有關(guān)。Sharma等[24]研究發(fā)現(xiàn)，谷子在發(fā)芽過程中黃酮類化合物和酚酸類化合物大量增加。黃酮類化合物通過抑制氧化應(yīng)激、改善脂質(zhì)代謝、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、減輕線粒體損傷、調(diào)節(jié)信號通路等機(jī)制作用，達(dá)到抗氧化作用[38]；酚酸類物質(zhì)通過捕捉自由基，主動提供氫原子切斷自動連鎖反應(yīng)機(jī)制作用，從而消除自由基和氧對人體的損傷[39]。發(fā)芽粟米明顯增強(qiáng)高脂血脂小鼠體內(nèi)組織抗氧化酶和抗氧化劑的活力，抑制過氧化物的生成，對高脂血癥引起的機(jī)體脂質(zhì)過氧化有顯著抑制作用，從而恢復(fù)機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡，有效減少脂質(zhì)過氧化物對心腦血管的損傷。

3 結(jié)論

發(fā)芽粟米具有降低小鼠體重和肝臟指數(shù)的作用，且劑量越高越明顯；發(fā)芽粟米有一定的調(diào)節(jié)血脂的作用，降低了小鼠血清和肝臟血脂中TC、TG、LDL-C水平，升高HDL-C水平。血清中效果明顯的是高劑量組，而肝組織中效果明顯的是中劑量組，可能與血清和肝組織中某些組分構(gòu)成不同有關(guān)，需具體進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)加以探索；發(fā)芽粟米降低血清和肝組織中的MDA含量，升高 GSH的含量和提高GSH-Px、SOD、CAT的活力，其中高劑量效果最好。因此，發(fā)芽粟米可以提高機(jī)體的抗氧化酶活力，并減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，有良好的抗氧化作用。綜上所述，發(fā)芽粟米喂養(yǎng)高血脂小鼠，可起到控制體重、調(diào)節(jié)血脂、抗氧化和保護(hù)肝臟的作用。