高通量測(cè)序法分析感楊樹灰斑病前后葉圍微生物多樣性1)

鄧世林 申東晨 潘理 劉思遠(yuǎn) 鄭浩楠 沈嘉乙 董愛榮

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

楊樹(Populusspp.)在我國(guó)主要用于防護(hù)林、用材林、水土保持林、農(nóng)田防護(hù)林和四旁綠化。楊樹灰斑病(CoryneumpopulinumBres.)是發(fā)生在楊樹(小苗到大樹)上的一種主要葉部病害。該病能使葉片提早脫落，嫩梢枯死或造成多頂苗[1]。目前,對(duì)楊樹灰斑病的防治主要以化學(xué)藥劑防治為主[2-3]，但化學(xué)殺菌劑常常帶來許多負(fù)面影響，如對(duì)環(huán)境的污染，對(duì)人畜的毒副作用等，因此必須尋找新的防治途徑克服農(nóng)藥殘留和病菌抗藥性的問題。近年來，運(yùn)用生物防治措施控制病害已成為病害防治的必然趨勢(shì)，這也是國(guó)際上目前在病害防治方面的重點(diǎn)研究領(lǐng)域，運(yùn)用拮抗微生物來防治灰斑病無疑是一種行之有效的方法[4-5]。獲得拮抗微生物的傳統(tǒng)方法是人工富集培養(yǎng)，然而，有研究表明自然界中存活的微生物只有0.1%～10.0%可以通過人工方法獲得純培養(yǎng)[6]，大量的微生物因無法獲得純培養(yǎng)而對(duì)其性質(zhì)及其在自然界中的生態(tài)功能知之極少。相比較而言，高通量測(cè)序法更為準(zhǔn)確快捷[7]，同時(shí)有利于探究在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下會(huì)忽略的低豐度菌群種類[8]。本研究基于高通量測(cè)序法分析楊樹感灰斑病前后葉圍微生物多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化,探知優(yōu)勢(shì)微生物的分布，從而指導(dǎo)篩選楊樹葉圍優(yōu)勢(shì)的灰斑病拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

健康小黑楊(Populussimonii×P.nigra)、發(fā)病小黑楊葉片均采自黑龍江省肇東市五站林木種子園。2019年7月24日，采用“S”形十點(diǎn)采樣法，分別剪取10棵2年根3年干健康及感灰斑病楊樹枝葉。健康樣品用A1表示，感病樣品用A2表示。

1.2 小黑楊葉圍微生物基因組DNA提取

稱取10.0 g來自于不同枝條上的小黑楊葉片，用無菌的剪刀剪碎后，放入10 mL離心管中，加入適量鋼珠和裂解液，在破碎儀上進(jìn)行破碎，參照OMEGA試劑盒E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的使用說明書，提取樣品DNA。利用Tris鹽酸緩沖液(pH=8.0)洗脫DNA并置于-20 ℃條件下凍存，送至生工生物工程(上海)股份有限公司完成擴(kuò)增子測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

細(xì)菌16S rRNA選擇341F和805R作為引物，引物序列分別為5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′和5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′；真菌ITS選擇ITS4F和ITS3R作為引物，分別為5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN-3′和5′-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA-3′，利用Illumina Mi Seq平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序和分析。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過QIIME(v1.8.0)軟件過濾、拼接、去除嵌合體，去除各樣本中reads尾部質(zhì)量值在20以下的堿基、切除reads中含N部分序列，并去除數(shù)據(jù)中的短序列(長(zhǎng)度閾值200 bp)，隨后再對(duì)低復(fù)雜度的序列進(jìn)行過濾。

采用Usearch(v7.1)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，物種比對(duì)注釋使用RDP classifier軟件，保留置信區(qū)間大于0.8的注釋結(jié)果。利用Mothur軟件進(jìn)行Chao1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)(Shannon)計(jì)算分析，并在各分類水平上進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的統(tǒng)計(jì)分析，得到微生物群落結(jié)構(gòu)組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病前后樣品的細(xì)菌和真菌多樣性

由表1可知，感病前后分別檢測(cè)到395、97個(gè)細(xì)菌OTU，2 144、954個(gè)真菌OTU，感病后樣品A2的OTU數(shù)、Shannon指數(shù)和Chao1指數(shù)明顯下降，說明感病后，病原菌占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且對(duì)其他微生物產(chǎn)生一定的抑制作用，細(xì)菌、真菌多樣性及物種總數(shù)顯著下降。

表1 感病前后小黑楊樣品的細(xì)菌和真菌多樣性指數(shù)

由圖1可知，感病前后樣品共含有492個(gè)細(xì)菌OTU，2組樣品共有的細(xì)菌種類僅有27個(gè)，占細(xì)菌總數(shù)的5.49%，說明楊樹感染灰斑病菌前后，葉圍細(xì)菌發(fā)生了較大改變。感病前后樣品共含有3 098個(gè)真菌OTU，2組樣品共有的真菌種類僅有22個(gè)，占真菌總數(shù)的0.71%，說明楊樹感染灰斑病菌前后，葉圍真菌發(fā)生了巨大的變化。這與表1的結(jié)果基本吻合。

2.2 感病前后樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異性

由表2可知，從細(xì)菌分類門的水平看，2個(gè)樣品主要含有5個(gè)門的細(xì)菌，包括：變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、廣古菌門(Euryarchaeota)和擬桿菌門(Bacteroidetes)。

在門水平下，感病前后樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不盡相同，A1樣品主要含有變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和擬桿菌門(Bacteroidetes)3個(gè)門，豐度分別為89.05%、7.13%和3.25%，三者合計(jì)高達(dá)99.43%，其他門以及未鑒定的細(xì)菌豐度均在0.27%以下。A2樣品主要含有變形菌門、厚壁菌門、廣古菌門、放線菌門和擬桿菌門5個(gè)門，豐度分別為82.48%、5.84%、5.11%、2.19%和1.09%，其他門以及未鑒定的細(xì)菌豐度均在0.73%以下。結(jié)果表明：楊樹感染灰斑病菌后，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了較大的變化，變形菌門、放線菌門和擬桿菌門豐度均不同程度下降，而其他細(xì)菌門豐度均呈不同程度上升。

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測(cè)出的細(xì)菌種類繁多，許多物種含量十分少，因此篩選出優(yōu)勢(shì)物種，對(duì)細(xì)菌平均豐度前15的物種進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。從細(xì)菌分類屬水平看，2個(gè)樣品豐度前15個(gè)屬的細(xì)菌，包括：鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、馬賽菌屬(Massilia)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)、Frondihabitans、根瘤菌屬(Rhizobium)、Methanoculleus、泛菌屬(Pantoea)、Hymenobacter、Aureimonas、芽孢桿菌屬(Bacillus)、氮單胞菌屬(Azomonas)、貪噬菌屬(Variovorax)和不動(dòng)桿菌屬(Acinetobacter)。

在屬水平下，2組樣品中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成也不盡相同，且差異較大的是相對(duì)豐度。A1中鞘氨醇單胞菌屬、甲基桿菌屬、馬賽菌屬、Frondihabitans、根瘤菌屬、Hymenobacter和Aureimonas豐度高于A2組，其中，Hymenobacter、Aureimonas僅存在于A1組中；而A2中假單胞菌屬、短波單胞菌屬、Methanoculleus、泛菌屬(Pantoea)、芽孢桿菌屬、氮單胞菌屬、不動(dòng)桿菌屬豐度高于A1組，其中，芽孢桿菌屬僅存在于A2組中。

表2 感病前后小黑楊樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分布

2.3 感病前后樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)差異性

由表3可知，從真菌分類門水平看，2組樣品主要含有3個(gè)門的細(xì)菌，即：子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)。

在門水平下，感病前后樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度。這說明2組樣品中群落結(jié)構(gòu)未發(fā)生根本改變。子囊菌門是樣品中的優(yōu)勢(shì)真菌，其中，A1樣品的豐度為56.81%，略大于A2樣品的豐度(46.50%)。其次是擔(dān)子菌門和接合菌門，其他和未鑒定的真菌平均豐度分別為40.60%和51.35%。

根據(jù)物種分類結(jié)果，由于樣品中所檢測(cè)出的真菌種類繁多，許多物種含量十分少，因此篩選出優(yōu)勢(shì)物種，只對(duì)真菌豐度前15的物種進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。從真菌分類屬水平看，2組樣品平均豐度前15個(gè)屬的真菌包括：部分無法確定的子囊菌(unclassified_Ascomycota)、鐮刀菌屬(Fusarium)、枝孢屬(Cladosporium)、棒盤孢屬(Coryneum)、尖座殼屬(Diaporthe)、炭疽菌屬(Colletotrichum)、短梗霉屬(Aureobasidium)、殼二孢屬(Ascochyta)、尾孢屬(Cercospora)、Plectosphaerella、青霉屬(Penicillium)、黃曲霉屬(Aspergillus)、Sydowia、短梗蠕孢屬(Trichocladium)和鏈格孢屬(Alternaria)。

表3 感病前后小黑楊樣品真菌群落結(jié)構(gòu)分布

在屬水平下，2組樣品中的真菌群落結(jié)構(gòu)組成基本相同，差異較大的是相對(duì)豐度。A1中部分無法確定的子囊菌、枝孢屬、短梗霉屬、殼二孢屬、青霉屬、黃曲霉屬、Sydowia、短梗蠕孢屬、鏈格孢屬豐度高于A2組，其中，短梗霉屬和Sydowia僅存在于A1組中；而A2中鐮刀菌屬、棒盤孢屬、尖座殼屬、炭疽菌屬、尾孢屬、Plectosphaerella豐度相較于A1組高，其中，尖座殼屬、炭疽菌屬和尾孢屬僅存在于A2組中。

3 結(jié)束語

本研究表明，小黑楊感灰斑病后，病葉上微生物物種數(shù)量較健康葉變化明顯，但在門及屬水平上差異不顯著。在門水平下，變形菌門是2組樣品中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，子囊菌門是2組樣品的優(yōu)勢(shì)真菌。在屬水平下，鞘氨醇單胞菌屬是健康葉中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，假單胞菌屬是病葉中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌；枝孢屬是健康葉中的優(yōu)勢(shì)真菌，鐮刀菌屬是病葉中的優(yōu)勢(shì)真菌，其次是棒盤孢屬。