響應(yīng)面優(yōu)化普魯蘭酶酶解玉米淀粉工藝研究

曹川 解鵬

摘?要：研究普魯蘭酶對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支工藝的影響.?以還原力（DE）為考察指標(biāo)，探討pH、溫度、加酶量和酶解時(shí)間對(duì)玉米淀粉脫支的影響，采用響應(yīng)面法對(duì)酶解過程中的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化.研究結(jié)果表明，在玉米淀粉脫支工藝單因素試驗(yàn)中最適的酶解條件是：pH?5.0，溫度50℃，加酶量7.2?U/g，酶解時(shí)間12?h;最佳酶解條件為：pH?5.3，加酶量8.1?U/g，溫度50℃.最佳條件下得到的?DE為0.57，較單因素試驗(yàn)的DE高，證明此優(yōu)化條件能較好地提高蠟質(zhì)玉米淀粉的脫支程度.

關(guān)鍵詞：普魯蘭酶;脫支;響應(yīng)面

[中圖分類號(hào)]TS234?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

Response?Surface?Methodology?for?Optimization?of?HydrolysisConditions?for?Corn?Starch?by?Pullulanase

CAO?Chuan1，2，XIE?Peng3

（1.College?of?Tea?and?Food，Anhui?Agricultural?University，Hefei?230001，Anhui，China;2.Department

of?Grain?Engineering，Anhui?Vocational?College?of?Grain?Engineering，Hefei?230011，Anhui，China;

3.Nanjing?University?of?Finance?and?Economics，Collaborative?Innovation?Center?for?Modern

Grain?Distribution?and?Safety，Nanjing?210046，China）

Abstract：To?research?the?effect?of?pullulanase?on?waxy?corn?starch?debranching?process.The?effect?of?enzyme?dosage，pH，temperature?and?time?on?the?enzymatic?hydrolysis?of?waxy?corn?starch?was?investigated?with?the?release?rate?of?reducing?sugar?（?DE）?as?the?index.The?response?surface?methodology?was?used?to?optimize?the?process?parameters?in?the?enzymolysis?process.Results：The?optimum?enzymolysis?conditions?of?waxy?corn?starch?pulullanse?content?of?7.2?U/g，temperature55℃，enzyme?solution?pH?5.0，enzymatic?hydrolysis?time?12?h;Response?surface?analysis?determined?the?optimal?enzymatic?conditions?were?pH?5.3，the?amount?of?enzyme?added?8.1?U/g?and?the?temperature?50?℃.Under?the?optimal?conditions?DE?is?0.57，which?is?higher?than?that?of?the?single?factor?test.It?is?proved?that?this?optimization?condition?can?better?improve?the?debranching?degree?of?waxy?corn?starch.

Key?words：pullulanse;debranched;Box-Behnken

普魯蘭酶（Pullulanase，?EC?3.2.1.41）是一種脫支酶，作為外切酶，能夠?qū)Ｒ恍缘那懈钇咸烟堑摩?1，6糖苷鍵，應(yīng)用于淀粉的脫支.脫支程度的增加使鏈重新結(jié)合形成新的晶體結(jié)構(gòu)，從而形成更多的抗性淀粉.[1]Berry[2]報(bào)道了用普魯蘭酶對(duì)馬鈴薯支鏈淀粉進(jìn)行脫支處理，使其RS3含量顯著增加.Selime?Mutlu[3]利用響應(yīng)面法（RSM）模擬脫支和微波輻照對(duì)高直鏈玉米淀粉性能的影響，將微波處理和酶改性方法與RSM模型相結(jié)合，有助于確定高抗性淀粉（RS）含量和低體外血糖指數(shù)值的最佳處理點(diǎn).本文以蠟質(zhì)玉米淀粉為原料，通過普魯蘭酶進(jìn)行淀粉脫支工藝研究，確定最佳的酶解條件，通過脫支生成線性短鏈淀粉，改善淀粉凝膠性能，提高分子聚集纏結(jié)能力和淀粉抗酶解能力，增強(qiáng)淀粉的流動(dòng)性和壓實(shí)性能，為淀粉基包埋產(chǎn)物緩慢釋放提供參考依據(jù).

1?材料與方法

1.1?供試材料

材料?玉米淀粉，蘇州君世科技化工科技有限公司.

儀器?LP202A型電子天平（江蘇常熟市衡器廠），超聲波清洗機(jī)（昆山超聲波儀器）;恒溫水浴（杭州惠爾儀器），?TLXJ-IIC臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)有限公司），T6型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），DF-1集熱式磁力攪拌器?（上海汗諾儀器有限公司），HY-5型振蕩器（常州國(guó)華儀器設(shè)備公司）.

試劑?氫氧化鈉、葡萄糖、碘液、無水乙醇、二甲基亞砜、苯酚、二硝基水楊酸、酒石酸鉀納、亞硫酸氫鈉等，購自上海國(guó)藥集團(tuán).普魯蘭酶，美國(guó)Sigma?公司.

1.2?脫支淀粉的制備

脫支淀粉的制備參考?Cai?和Liu的方法.[4]將一定質(zhì)量的蠟質(zhì)玉米淀粉置于500mL?0.01mol/L醋酸鈉緩沖液（pH5.0）中，制備10%乳液，磁力攪拌器在95℃條件下攪拌30min.調(diào)節(jié)pH，高壓蒸汽121℃，30min，完全糊化.置于沸水浴中攪拌10min，當(dāng)?shù)矸酆臏囟冉抵?0℃時(shí)，加入普魯蘭酶進(jìn)行脫支12h.脫支結(jié)束后，100℃煮沸滅酶10min，無水乙醇定容至1?000mL.離心機(jī)離心收集沉淀物，冷凍干燥，過篩100目，最后得到脫支的蠟質(zhì)玉米淀粉.

1.3?測(cè)定項(xiàng)目及分析方法

單因素試驗(yàn)?淀粉的脫支程度由還原力DE值決定，采用二硝基水楊酸法（DNS）在540nm處測(cè)量樣品的吸光度.以DE為衡量指標(biāo)，分別對(duì)加酶量、pH、溫度和酶解時(shí)間進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，得出各個(gè)因素對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉DE的變化趨勢(shì)圖.

酶解工藝條件的優(yōu)化及響應(yīng)面分析?為獲得蠟質(zhì)玉米淀粉最佳脫支條件，對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素水平，通過Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳工藝條件.

酶解優(yōu)化試驗(yàn)因素和水平?通過中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)溫度、pH和酶用量三個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化.以脫支后上清液中DE的變化作為響應(yīng)值，三個(gè)自變量pH、溫度和加酶量分別用A，B，C代表，結(jié)果見表1.采用origin8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，作折線圖進(jìn)行比較，用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，顯著水平為P<0.05.

2?結(jié)果與分析

2.1?蠟質(zhì)玉米淀粉脫支單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

普魯蘭酶用量對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液糊化完全，調(diào)節(jié)pH為5.0，分別加酶量1.8，3.6，?5.4，7.2，9.0U/g，置于50℃下酶解12h.結(jié)果見圖1.由圖1可知，當(dāng)普魯蘭酶添加量較少時(shí)，分子被切斷程度不夠，淀粉未完全脫支;添加量太大，蠟質(zhì)玉米淀粉已經(jīng)基本酶解完全，底物已經(jīng)耗完，再增加酶用量對(duì)DE值的影響不大.考慮到經(jīng)濟(jì)效益和酶解效果，選擇加酶量為7.2U/g.

pH對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液糊化完全，加酶量為7.2U/g，分別調(diào)節(jié)pH為4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，置于50℃水浴下酶解12h.結(jié)果見圖2.酶與底物的結(jié)合能力和催化能力受到pH影響，由圖2可以看出，pH4.0～5.0時(shí)DE值隨著pH的上升而增加，pH大于5.0后，DE值反而隨著pH值的升高而下降.因此，酶解的最適宜pH是5.0.

溫度對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液糊化完全，調(diào)節(jié)pH為5.0，加酶量為7.2U/g，分別置于45，50，55，60，65℃水浴下酶解12h.結(jié)果見圖3.圖3表明，最佳反應(yīng)溫度是50℃，溫度會(huì)影響酶的催化效率[5]，普魯蘭酶作用溫度過高過低都不利于淀粉的脫支.在45～50℃隨著溫度增加DE值增加，超過50℃，隨著脫支溫度的增加，普魯蘭酶的活性降低或者因過高溫度普魯蘭酶失活，DE下降.

酶解時(shí)間對(duì)蠟質(zhì)玉米淀粉脫支程度的影響?10%的蠟質(zhì)玉米淀粉溶液糊化完全，調(diào)節(jié)pH為5.0，加酶量為7.2U/g，置于50℃水浴下分別酶解3，6，9，12，24，48h.結(jié)果見圖4.由圖4可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶與底物的接觸和反應(yīng)越來越充分，普魯蘭酶作用時(shí)間在0～24?h曲線上升，普魯蘭酶作用時(shí)間為12h時(shí)，曲線上升到最高點(diǎn).酶是緩慢作用于支鏈淀粉專一切開α-1，6糖苷鍵，脫支時(shí)間大于12h時(shí)，蠟質(zhì)玉米淀粉的支鏈部分已基本被切開，蠟質(zhì)玉米淀粉的脫支程度不再隨著時(shí)間的增加而顯著增加.

2.2?響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

利用Design?Expert?8.0對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行處理分析，回歸方程的方差分析、參數(shù)估計(jì)及顯著性分析結(jié)果見表2.

利用Design?Expert?8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合方程：

還原力DE=55.04-0.79*A+0.61*B+1.51*C+0.15*A*B+7.500E-003*A*C-0.39*B*C-5.61*A²-3.86*B²-7.15*?C².

二次回歸模型的F值為127.73，P<0.000?1，

大于在0.01水平上的F值;失擬項(xiàng)的F值為3.22，失擬項(xiàng)不顯著，說明該模型擬和結(jié)果好，BC的交互作用對(duì)DE有顯著的影響.模型與試驗(yàn)擬合效果較好，可用于對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.利用Design?Expert?8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到的二次回歸方程的響應(yīng)曲面圖[6]見圖5-7.

由圖5可知，pH和溫度增加時(shí)，DE先升高后降低，等高線形狀橢圓形，pH與溫度的交互作用對(duì)反應(yīng)有顯著影響.[7]由圖6和圖7可知，還原力DE先勻速上升后迅速下降，響應(yīng)面比較陡峭，說明DE對(duì)加酶量、溫度、pH的變化敏感.為了進(jìn)一步求得各因素的最佳條件組合，通過對(duì)模型方程的求解，得到曲面的最大值.對(duì)回歸方程求導(dǎo)，并令其等于零，可以得到曲面的最大點(diǎn)，即3個(gè)主要因素的最佳水平值，轉(zhuǎn)換后得到提取的最佳條件為A=5.34，B=49.86，C=8.18.為檢驗(yàn)響應(yīng)曲面的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進(jìn)行試驗(yàn)[8]，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證.考慮到實(shí)際操作的便利，將酶解工藝參數(shù)修正為：pH5.3，溫度50℃，加酶量8.10U/g，該條件下得到的DE分別為0.572?4，0.571?3，0.570?1，0.572?3，0.571?9，0.572?1，平均值為0.571?7，偏差不大，保持在0.57的水平，證明該結(jié)果是合理可靠的.

3?結(jié)果與討論

采用單因素試驗(yàn)，確定酶解的pH、時(shí)間、溫度和加酶量的最優(yōu)條件.通過響應(yīng)曲面法的優(yōu)化，證明DE與3個(gè)關(guān)鍵因子（加酶量，溫度，pH）的二次多項(xiàng)回歸模型是合理可靠的.利用Design?Expert軟件對(duì)關(guān)鍵因子及其相互作用進(jìn)行分析，得出酶解最佳條件：pH為5.3，加酶量為?8.1U/g，溫度為?50℃，該條件下得到的蠟質(zhì)玉米淀粉的還原力0.57以上.該研究可以為有效科學(xué)地利用淀粉脫支工藝將脫支淀粉應(yīng)用于包埋運(yùn)載藥物及活性物質(zhì)等，提供重要的技術(shù)基礎(chǔ).

參考文獻(xiàn)

[1]Lin?J-H，Chang?Y-H.Effects?of?type?and?concentration?of?polyols?on?the?molecular?structure?of?corn?starch?kneaded?with?pullulanase?in?a?Farinograph[J].Food?Hydrocolloids，2006（20）：340-347.

[2]Berry?CS.Resistant?starch：Formation?and?measurement?of?starch?that?survives?exhaustive?digestion?with?amylolytic?enzymes?during?the?determination?of?dietary?fibre[J].Journal?of?Cereal?Science，1986（4）：301-304.

[3]Selime?Mutlu，Kevser?Kahraman，Sebnem?Severcan，Serpil?O··ztürk.Modelling?the?Effects?of?Debranching?and?Microwave?Irradiation?Treatments?on?the?Properties?of?High?Amylose?Corn?Starch?by?Using?Response?Surface?Methodology[J].Food?Biophysics，2018（9）：263-273.

[4]Liming?CAI，Yong-ChengSHI，Lixia?RONG?et?al.Debranching?and?crystallization?of?waxy?maize?starch?in?relation?to?enzyme?digestibility[J].Carbohydrate?Polymers，2010，81（2）：385-393.

[5]彌春霞，代志平，楊蕾.?酸奶中嗜熱鏈球菌的分離及鑒定[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007（3）：35-36.

[6]曹川，包建強(qiáng).響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助提取貽貝蛋白的工藝研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（5）：258-261.

[7]王茜，王啟之，時(shí)維靜，等.響應(yīng)面法與正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化黃蜀葵總黃酮閃提工藝比較[J].安徽科技學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，29（5）：24-31.

[8]黃艷勝.溫度對(duì)玉米種子萌發(fā)能力的影響[J].牡丹江師范學(xué)院學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007（1）：23-24.

編輯：琳莉

收稿日期：2019-12-01

基金項(xiàng)目：安徽省科技攻關(guān)項(xiàng)目（1704a07020098）;?2016年高等學(xué)校省級(jí)質(zhì)量工程項(xiàng)目（?2016jxtd038）

作者簡(jiǎn)介：曹川（1988-），女，安徽肥西人.講師，博士，主要從事糧食儲(chǔ)藏與檢測(cè)科研;解?鵬（1988-），男，安徽肥西人.博士，主要從事糧食流通領(lǐng)域研究.