應(yīng)用SSR標(biāo)記鑒定甜瓜流星翡翠的種子純度

武婷，郭誠，巫水欽，俞洋，鐘六鳳，俞金龍

(浙江美之奧種業(yè)股份有限公司，浙江 嘉興 314000)

甜瓜(CucumismeloL.)是世界上重要的高產(chǎn)出、高效益果用蔬菜作物，在世界各地廣泛種植，我國是世界甜瓜生產(chǎn)與消費(fèi)第一大國。甜瓜為異花授粉植物，生產(chǎn)的商品種絕大部分為雜交種，而雜交種在制種過程中，容易因去雄不徹底導(dǎo)致自花授粉，從而降低種子純度。甜瓜的種子純度直接影響著甜瓜的品質(zhì)和產(chǎn)量，對(duì)農(nóng)民的生產(chǎn)種植收益甚為重要。因此，雜交種種子真實(shí)性和純度鑒定是評(píng)價(jià)甜瓜種子質(zhì)量最主要的因素[1]。

目前，甜瓜雜交種純度鑒定的傳統(tǒng)方法是田間鑒定，此方法主要是根據(jù)形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行鑒定，其鑒定周期長、費(fèi)工費(fèi)力、成本高，且易受環(huán)境因素影響。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，簡單重復(fù)序列標(biāo)記(SSR標(biāo)記)具有共顯性遺傳、多態(tài)性高、數(shù)量豐富、不易受環(huán)境因素影響等特點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用，SSR標(biāo)記能夠高效、準(zhǔn)確地對(duì)種子純度做出鑒定[2]。本研究利用來自公開發(fā)表的文獻(xiàn)和葫蘆科作物數(shù)據(jù)庫的124對(duì)SSR標(biāo)記引物，篩選甜瓜流星翡翠及其父母本材料間數(shù)對(duì)多態(tài)性引物，用于流星翡翠雜交種純度鑒定，以期建立一套高效、準(zhǔn)確、成本低的室內(nèi)雜交種種子純度檢測技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為甜瓜雜交種流星翡翠及其親本種子，由浙江美之奧種業(yè)股份有限公司自主選育。

1.2 方法

1.2.1 浸種催芽育苗

50 ℃水浴浸種20 min，再用自來水清洗，然后將種子用濕毛巾包裹，放置于保濕盤中，于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃催芽(暗)，胚根2 cm左右時(shí)進(jìn)行穴盤播種育苗。

1.2.2 DNA提取

以288份流星翡翠F1代單株及其親本材料各12株為樣本，取其幼嫩葉片1 cm2左右于2 mL離心管中。采用SDS抽提法提取基因組DNA[3]，使用超微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop One檢測DNA濃度和質(zhì)量，于4 ℃保存。

1.2.3 PCR擴(kuò)增與電泳檢測

124對(duì)SSR標(biāo)記引物來自公開發(fā)表的文獻(xiàn)和葫蘆科作物數(shù)據(jù)庫，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(20 μL)：DNA模板2 μL(≈200 ng)，上下游引物各2 μL(10 μmol·L-1)，2×FTaqMasterMix(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)10 μL，加ddH2O至體積20 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 種子純度鑒定分析

利用能有效區(qū)分雜交種和父母本的多態(tài)性SSR標(biāo)記引物，進(jìn)行雜交種F1代種子純度鑒定。根據(jù)擴(kuò)增PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳帶型，統(tǒng)計(jì)具有父母本特征條帶的個(gè)體數(shù)量，鑒定為有效雜交種，反之為假雜種，并計(jì)算雜交種純度。雜交種純度=(同時(shí)具有父母本條帶的株數(shù)/檢測的總株數(shù))×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性引物篩選

利用124對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)甜瓜流星翡翠及其父母本材料進(jìn)行DNA擴(kuò)增，4%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，篩選親本間具有條帶清晰、多態(tài)性差異明顯且可穩(wěn)定重復(fù)的引物。結(jié)果如圖1所示，獲得多態(tài)性標(biāo)記引物共3對(duì)，分別為GCM90(F: 3′-GGGTGGATTCACTATTTGC-5′；R: 3′-TTAATCTGG CCGCTTATTC-5′)、GCM92(F: 3′-CAGAAATTTTG GCCTGAAC-5′；R: 3′-CCTGAGTTATTGCAGAGGG-5′)和GCM119(F: 3′-TATTATCCAACGCCTGTCC-5′；R: 3′-CCTGAGTTATTGCAGAGGG-5′)。這3對(duì)引物擴(kuò)增的譜帶易于區(qū)分親本和雜交種，各引物擴(kuò)增的親本材料均為差異的單條帶，雜交種為父母本互補(bǔ)的雙條帶，符合實(shí)驗(yàn)種子純度鑒定要求，可以用來鑒定流星翡翠雜交種的種子純度。

M為100 bp DNA Ladder；泳道1～6為GCM90引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道7～12為GCM92引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道13～18為GCM119引物擴(kuò)增結(jié)果；泳道1、2、7、8、13和14為父本材料；泳道3、4、9、10、15和16為母本材料；泳道5、6、11、12、17和18為流星翡翠雜交種材料。圖1 三對(duì)SSR引物在甜瓜流星翡翠及其親本材料中的擴(kuò)增結(jié)果

2.2 甜瓜流星翡翠的種子純度鑒定

使用GCM90、GCM92和GCM119多態(tài)性SSR引物對(duì)流星翡翠雜交種進(jìn)行種子純度鑒定，共檢測株數(shù)288份，結(jié)果如圖2所示。這3對(duì)SSR引物均擴(kuò)增到1份材料為單條帶，且為同一份，這份材料為母本型條帶。因此該批次流星翡翠的種子純度為99.65%。出現(xiàn)1份材料為假雜種的原因可能為制種過程中去雄工作不徹底，導(dǎo)致母本自交結(jié)實(shí)。

M為100 bp DNA Ladder；泳道1～24為流星翡翠雜交種材料。圖2 引物GCM90、GCM92、GCM119對(duì)甜瓜流星翡翠材料的擴(kuò)增結(jié)果

3 小結(jié)與討論

農(nóng)作物種子純度鑒定主要有傳統(tǒng)的田間農(nóng)藝性狀調(diào)查和室內(nèi)分子標(biāo)記技術(shù)快速檢測。傳統(tǒng)的田間品種純度鑒定周期長，耗時(shí)耗人工，成本高，且易受環(huán)境條件影響，純度準(zhǔn)確度有所偏差。相比之下，DNA分子標(biāo)記鑒定效率高，穩(wěn)定性好，只需要?jiǎng)內(nèi)さ姆N子、胚根或者苗期的幼嫩葉片就可以作為材料用于純度鑒定，省時(shí)省力，精確度高。甜瓜流星翡翠分別于2018、2019年進(jìn)行品種試驗(yàn)和展示。種植戶反饋田間觀察出現(xiàn)個(gè)別皮色不一致瓜果，純度達(dá)99%以上，在種子純度合格范圍。本研究SSR標(biāo)記純度鑒定結(jié)果與田間純度調(diào)查結(jié)果基本一致。

SSR標(biāo)記呈共顯性遺傳，可區(qū)分雜合種和自交種，數(shù)量豐富，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、結(jié)果穩(wěn)定高效等諸多優(yōu)點(diǎn)[4]，廣泛地應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助育種、DNA指紋圖譜庫的構(gòu)建和品種鑒定等研究。目前，甜瓜制種的主要措施仍然是人工去雄授粉，在雜交制種過程中去雄不徹底，易獲得自交種子，與雜交種子混雜，導(dǎo)致雜交種純度一般達(dá)不到100%[5]。為保證種子質(zhì)量，保障農(nóng)民經(jīng)濟(jì)效益，雜交種純度鑒定和真實(shí)性鑒定是一項(xiàng)重要的指標(biāo)。本研究用124對(duì)SSR標(biāo)記引物對(duì)甜瓜流星翡翠雜交種和親本進(jìn)行擴(kuò)增，篩選到3對(duì)多態(tài)性引物，可用于流星翡翠雜交種純度鑒定。多對(duì)引物組合鑒定，可進(jìn)一步保證檢測的準(zhǔn)確性。本研究還表明，瓊脂糖凝膠濃度為4%時(shí)，親本間擴(kuò)增片段差異區(qū)分效果好，能獲得更多的多態(tài)性標(biāo)記。