肥大細(xì)胞在小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎疼痛中的作用及其機(jī)制研究*

董甜甜，王金齡，李世剛，柳 蔚，閆夢真，余 婕，陳桂婷，周婷婷

（三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北宜昌443002）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性自身免疫性疾病，以滑膜增生，關(guān)節(jié)軟骨與骨的破壞為特征，伴有慢性持續(xù)性的關(guān)節(jié)疼痛，嚴(yán)重危害患者的身心健康，影響患者的生活質(zhì)量［1］。世界范圍內(nèi)大約1%的人口患有RA［2］，大部分都遭受著疼痛的折磨，臨床使用糖皮質(zhì)激素［3］、傳統(tǒng)抗風(fēng)濕藥和解熱鎮(zhèn)痛藥并不能達(dá)到理想鎮(zhèn)痛效果，且易出現(xiàn)一系列的藥物耐受現(xiàn)象和副作用［4-5］；為減輕更多RA患者的痛苦，提高整體生活質(zhì)量，迫切需要了解關(guān)節(jié)疼痛的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)新的治療靶點，尋找新的風(fēng)濕鎮(zhèn)痛藥。

肥大細(xì)胞來源于骨髓造血干細(xì)胞［6］，離開骨髓后以肥大細(xì)胞前體形式隨血流遷移，最后定居于全身各處結(jié)締組織中增殖分化為成熟的肥大細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)，其一旦活化可脫顆粒釋放出多種炎性介質(zhì)，包括類胰蛋白酶（tryptase）、組胺（histamine）和肝素（heparin）和神經(jīng)生長因子（never growth factor，NGF）等。早期研究發(fā)現(xiàn)肥大細(xì)胞在RA的病理發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色，RA患者和實驗性關(guān)節(jié)炎小鼠滑膜組織中肥大細(xì)胞數(shù)量和活化的肥大細(xì)胞數(shù)較正常滑膜組織明顯增加，而肥大細(xì)胞缺乏的小鼠關(guān)節(jié)炎癥明顯減輕［7-8］，證實了肥大細(xì)胞在RA的發(fā)生發(fā)展過程中可能起著關(guān)鍵性作用。

肥大細(xì)胞在其它疾病所致疼痛過程中也發(fā)揮重要作用。例如，鐮狀細(xì)胞性貧血導(dǎo)致的疼痛過程中皮膚組織肥大細(xì)胞脫顆粒增加，而經(jīng)肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑處理的小鼠和肥大細(xì)胞缺乏的KitW-v小鼠痛覺過敏反應(yīng)減輕［9］；肥大細(xì)胞缺乏的Kitw-sh小鼠誘導(dǎo)慢性膀胱炎，其炎癥病理表現(xiàn)和盆腔疼痛較野生型小鼠明顯減輕，對其進(jìn)行C57BL/6J小鼠骨髓來源的肥大細(xì)胞再移植后，盆腔疼痛和病理表現(xiàn)再次出現(xiàn)，經(jīng)H1和H2受體拮抗劑治療后盆腔疼痛緩解［10］。這說明肥大細(xì)胞及其脫顆粒介質(zhì)在慢性炎癥性疼痛病理中可能發(fā)揮作用。

雖然肥大細(xì)胞參與多種疾病疼痛病理過程，卻未見肥大細(xì)胞與RA疼痛的相關(guān)報道，本研究基于肥大細(xì)胞在RA炎癥病理過程中發(fā)揮的作用，推測肥大細(xì)胞可能也介導(dǎo)了關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生。本項工作采用完全弗氏佐劑（complete Freund′s adjuvant，CFA）構(gòu)建小鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）疼痛模型［11］，探討肥大細(xì)胞在RA關(guān)節(jié)疼痛中的作用及其可能機(jī)制。

材料和方法

1 材料

SPF級雌性C57BL/6小鼠18只，體重20～30 g，周齡為6～8周，購自湖北省實驗動物研究中心，許可證號為SCXK（鄂）2015-0018。雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突變小鼠，背景品系為C57BL/6J小鼠，體內(nèi)肥大細(xì)胞缺乏）6只，體重20～30 g，由杭州師范大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（浙）2011-0048。PL-200熱刺痛儀（成都泰盟科技有限公司）；von Frey電子測痛儀（ALMEMO 2390-5，AHLBORN）；游標(biāo)卡尺（東莞市景有模具五金有限公司）；多功能顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Leica）；酶標(biāo)儀（Tecan）。CFA（Chondrex）；甲苯胺藍(lán)（toluidine blue，TB；武漢谷歌生物科技有限公司）；色甘酸鈉（cromolyn sodium，CS；一種肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑；上海生工生物工程有限公司）；ELISA試劑盒（上海鑫樂生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 動物分組及給藥 將正常雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組：正常對照組（control組）、AA模型組（model組）和AA模型+CS組（CS組），每組6只。6只雌性KitW-4Bao小鼠（Kit基因突變小鼠，背景品系為C57BL/6J小鼠，表現(xiàn)為肥大細(xì)胞缺乏）作為AA模型+肥大細(xì)胞缺失組（W-4Bao組）。除control組注射等體積生理鹽水外，其它各組小鼠右后足底皮下注射CFA 30 μL構(gòu)建AA模型［11-12］，1 d后觀察到注射側(cè)足掌明顯紅腫說明造模成功。CS組小鼠在CFA注射1 d后開始腹腔注射CS（20 mg/kg）［9］，其余各組小鼠均給予等體積生理鹽水，每日1次，持續(xù)給藥14 d。

2.2 小鼠足趾腫脹度測定 分別于小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用游標(biāo)卡尺測量小鼠雙后肢的足掌厚度［13］。

2.3 機(jī)械刺激縮爪反應(yīng)閾值（paw withdrawal threshold，PWT）測量 分別在致炎第0、1、3、7、10和14天使用von Frey電子測痛儀檢測機(jī)械疼痛閾值［12］。將小鼠置于透明的玻璃器皿下，底為1 cm×1 cm孔徑的鐵絲網(wǎng)，待小鼠適應(yīng)30 min后開始檢測。用一根連接在von Frey電子測痛儀探頭上的金屬絲（直徑約為0.5 mm）垂直向上刺激小鼠足底，小鼠抬足的瞬間記錄下疼痛閾值（g），每只足重復(fù)測量3次取平均值，每次測量間隔15 s。

2.4 熱刺激縮爪反應(yīng)潛伏期（paw withdrawal latency，PWL）測量 在小鼠致炎第0、1、3、7、10和14天使用熱刺痛儀檢測小鼠縮爪反應(yīng)時間［12］。測定前，將小鼠置于熱刺痛儀的玻璃板上，并用透明玻璃杯限制其活動范圍，適應(yīng)環(huán)境30 min，待小鼠處于安靜狀態(tài)時，開始進(jìn)行檢測。移動輻射熱光源，對準(zhǔn)小鼠后足貼近玻璃板的部位，從給予輻射熱刺激開始計時，直至大鼠產(chǎn)生縮爪反應(yīng)時記錄下縮爪反應(yīng)潛伏時間（s）。每只小鼠測試間隔10 min以上，測試3次取平均值。

2.5 關(guān)節(jié)組織病理評價 14 d后處死小鼠，獲取右后肢踝關(guān)節(jié)，4%多聚甲醛固定后，組織浸于10%EDTA進(jìn)行脫鈣，至骨組織變軟后進(jìn)行常規(guī)脫水，石蠟包埋切片。切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察踝關(guān)節(jié)組織的病理改變，進(jìn)行關(guān)節(jié)炎評分［12］：根據(jù)組織病變程度分為4級，逐級記為0～3分，累計總分為關(guān)節(jié)組織病理分?jǐn)?shù)，最嚴(yán)重的病理評分可達(dá)9～10分，見表1。

表1 關(guān)節(jié)組織病理評分系統(tǒng)Table 1.Joint histopathology scoring system

2.6 TB染色 小鼠踝關(guān)節(jié)組織石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟水化后用0.5%TB染液染色5 min，沖洗后冰醋酸分化數(shù)秒，經(jīng)脫水，二甲苯透明后封片。切片在光學(xué)顯微鏡下觀察到的含紫紅色顆粒的細(xì)胞為肥大細(xì)胞，其中細(xì)胞膜完整、細(xì)胞核染色清楚的為穩(wěn)定狀態(tài)肥大細(xì)胞；細(xì)胞膜破裂、周圍組織中存在藍(lán)染顆粒的為脫顆粒肥大細(xì)胞［14］。選取不同視野進(jìn)行肥大細(xì)胞計數(shù)，每張切片選擇3個視野進(jìn)行計數(shù)，求平均值，并計算肥大細(xì)胞脫顆粒率。脫顆粒率（%）=脫顆粒肥大細(xì)胞數(shù)量/肥大細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.7 酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測小鼠踝關(guān)節(jié)組織中炎癥因子和神經(jīng)肽水平 取小鼠踝關(guān)節(jié)加入PBS進(jìn)行組織勻漿，吸取上清，參考ELISA試劑盒說明書檢測上清中histamine、tryptase、P物質(zhì)（substance P，SP）和降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）的濃度［15］。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計，組間均數(shù)多重比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠致炎前后足趾腫脹度

小鼠注射CFA 1 d后，致炎側(cè)后肢肉眼可見明顯紅腫，對側(cè)及注射生理鹽水的小鼠未見明顯改變；經(jīng)測量，與正常control組相比，model組小鼠的右側(cè)足掌厚度在致炎1 d后顯著增加（P＜0.05），腫脹持續(xù)至14 d，小鼠伴有跛行和舔足反應(yīng)，見圖1。

2 熱刺激（PWL）和機(jī)械刺激（PWT）痛敏反應(yīng)

小鼠致炎1 d后，注射CFA的一側(cè)后肢PWL和PWT較control組顯著降低（P＜0.05），痛覺過敏持續(xù)至14天，對側(cè)后肢以及正常control組的后肢未見明顯疼痛反應(yīng)，與注射CFA的model組野生型小鼠相比，KitW-4Bao小鼠痛閾值保持在較高水平（P＜0.05）；經(jīng)CS干預(yù)治療后的第7天開始，小鼠PWL和PWT逐漸升高，與model組小鼠相比有顯著差異（P＜0.05），見圖1。

3 關(guān)節(jié)組織病理評分

組織切片經(jīng)HE染色顯示，control組關(guān)節(jié)面光滑，未見炎癥細(xì)胞浸潤和滑膜增生；model組關(guān)節(jié)腔狹窄，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤、關(guān)節(jié)滑膜增生等典型關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)；CS組較model組炎癥表現(xiàn)明顯減輕，炎癥細(xì)胞，滑膜增生減少；W-4Bao組炎癥癥狀不明顯。組織病理分?jǐn)?shù)統(tǒng)計分析結(jié)果顯示model組小鼠評分顯著高于control組（P＜0.05），W-4Bao組和CS組的評分顯著低于model組（P＜0.05）。見圖2。

Figure 1.The swelling of the paw and the pain threshold before and after the inflammation in mice.A：visual observation of right hind paw swelling in mice；B：ankle thickness change in control group and model group.C：the changes of paw withdrawal latency in control group，model group，W-4Bao group and CS group；D：the changes of paw withdrawal threshold in control group，model group，W-4Bao group and CS group.Mean±SD，n=6.*P＜0.05 vs control group，#P＜0.05 vs model group.圖1 小鼠致炎前后足掌腫脹情況和痛域變化

4 肥大細(xì)胞脫顆粒情況

Figure 2.HE staining and pathological score of mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）.The scale bar=100 μm.The arrows indicate joint cavity narrowing，synovial hyperplasia，and inflammatory cell infiltration.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖2 關(guān)節(jié)組織病理評分

踝關(guān)節(jié)組織切片TB染色結(jié)果顯示，model組較control組總的肥大細(xì)胞數(shù)量和脫顆粒的肥大細(xì)胞均顯著增加（P＜0.05），W-4Bao組幾乎未見肥大細(xì)胞，CS組較model組的肥大細(xì)胞數(shù)量及脫顆粒率均顯著降低（P＜0.05），見圖3。

Figure 3.The number of mast cells and the degranulation rate of mast cells in mouse joint tissues in control group（A），model group（B），W-4Bao group（C）and CS group（D）were evaluated by toluidine blue staining（scale bar=20 μm）.The red arrows indicate stable mast cells，while the yellow arrows indicate degranulated mast cells.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group.圖3 踝關(guān)節(jié)組織肥大細(xì)胞活化情況

5 踝關(guān)節(jié)組織炎癥因子和神經(jīng)肽釋放情況

ELISA法檢測結(jié)果顯示，model組中histamine、tryptase、SP和CGRP的表達(dá)量均比control組顯著升高（P＜0.05），其在CS組和W-4Bao組中的表達(dá)量較model組顯著降低（P＜0.05），見表2。

表2 各組踝關(guān)節(jié)組織炎癥因子和神經(jīng)肽釋放水平比較Table 2.Comparison of release levels of inflammatory factors and neuropeptides in ankle joint tissues of each group（μg/L.Mean±SD，n=6）

討 論

目前國內(nèi)外針對肥大細(xì)胞在RA中的作用研究多集中在炎癥方面，對RA疼痛研究較少。弗氏佐劑關(guān)節(jié)炎可產(chǎn)生動物自身免疫反應(yīng)性炎癥，模擬RA引起的疼痛，屬于慢性疼痛模型，適用于RA疼痛發(fā)病機(jī)制及鎮(zhèn)痛藥物作用的研究［13］。本實驗通過小鼠右后肢足底皮下注射CFA，構(gòu)建AA疼痛模型，1 d后小鼠注射側(cè)明顯紅腫，活動受限并伴隨一些疼痛反射行為，提示造模成功。

肥大細(xì)胞在組織中通常鄰近血管和神經(jīng)分布，肥大細(xì)胞脫顆粒可調(diào)節(jié)神經(jīng)興奮性，反過來神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)也可活化肥大細(xì)胞。在交感神經(jīng)元與大鼠嗜堿性粒細(xì)胞性白血病RBL-2H3細(xì)胞以及大鼠腹腔肥大細(xì)胞共培養(yǎng)實驗中，觀察到神經(jīng)元和肥大細(xì)胞的膜與膜之間形成類似突觸樣聯(lián)系，用緩激肽刺激神經(jīng)細(xì)胞可觀察到RBL-2H3細(xì)胞活化并出現(xiàn)細(xì)胞膜的波動現(xiàn)象［16］，這一現(xiàn)象直觀表明了肥大細(xì)胞與神經(jīng)之間存在著某種內(nèi)部聯(lián)系，為肥大細(xì)胞在疼痛病理過程中發(fā)揮作用提供了依據(jù)。

機(jī)械和熱刺激痛閾的測定被廣泛用于評估實驗動物疼痛等級。為證實肥大細(xì)胞在CFA誘導(dǎo)的AA疼痛中的作用，本研究采用肥大細(xì)胞缺乏的KitW-4Bao小鼠［17］誘導(dǎo)AA模型，同時對AA模型小鼠使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑CS進(jìn)行干預(yù)治療。實驗結(jié)果顯示：model組小鼠的PWL和PWT較control組顯著降低，而CS組和W-4Bao組小鼠痛閾均高于Model組，從疼痛行為學(xué)的角度證實肥大細(xì)胞能夠促進(jìn)關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生。

肥大細(xì)胞在組織免疫炎癥狀態(tài)下，通過脫顆粒釋放出多種炎性介質(zhì)，如histamine和tryptase等，通過炎性介質(zhì)與組織細(xì)胞的相互作用，放大炎癥信號，導(dǎo)致持續(xù)性的慢性炎癥發(fā)生和發(fā)展［18-19］。本實驗通過TB染色觀察肥大細(xì)胞在踝關(guān)節(jié)組織中的分布及活化情況，結(jié)果觀察到control組踝關(guān)節(jié)組織中肥大細(xì)胞數(shù)量以及活化數(shù)量較少，而model組中肥大細(xì)胞數(shù)量和活化脫顆粒的肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加，肥大細(xì)胞缺乏的W-4Bao組以及使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑處理后的CS組的肥大細(xì)胞活化程度均減輕。ELISA檢測踝關(guān)節(jié)組織勻漿中炎癥介質(zhì)histamine和tryptase的釋放情況，結(jié)果顯示model組中這兩種炎癥介質(zhì)含量較control組明顯增加，而CS組和W-4Bao組較model組含量降低，表明CFA誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎能夠促進(jìn)肥大細(xì)胞活化，組織中肥大細(xì)胞數(shù)量與關(guān)節(jié)炎癥嚴(yán)重程度具有一定關(guān)系，抑制肥大細(xì)胞活化能有效緩解關(guān)節(jié)炎癥和疼痛。

SP和CGRP是在疼痛過程中起重要作用的神經(jīng)遞質(zhì)，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)，由感覺神經(jīng)元分泌，在傷害性機(jī)械、熱和化學(xué)等刺激下，神經(jīng)末梢被激活可釋放大量SP和CGRP，在慢性炎癥疼痛中發(fā)揮重要作用。先前的研究證實關(guān)節(jié)中存在大量的肽能神經(jīng)元能夠分泌SP和CGRP，在膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎中觀察到背根神經(jīng)節(jié)（dorsal root ganglion，DRG）神經(jīng)元和脊髓背角中CGRP表達(dá)上調(diào)，痛覺敏感性增強(qiáng)［20］；在CFA誘導(dǎo)的大鼠慢性膝關(guān)節(jié)炎模型中出現(xiàn)同側(cè)小直徑DRG神經(jīng)元CGRP陽性表達(dá)率明顯增加［21］。有研究［22］表明雷公藤甲素能夠抑制AA大鼠脊髓背角和DRG中SP的表達(dá)，并緩解了50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾值。對于慢性關(guān)節(jié)炎癥（RA和骨關(guān)節(jié)炎）的研究顯示關(guān)節(jié)炎病人血清SP濃度與慢性疼痛強(qiáng)度呈正相關(guān)關(guān)系［23］，在炎癥狀態(tài)下，關(guān)節(jié)周圍組織中的神經(jīng)纖維及相應(yīng)受體被激活，可釋放神經(jīng)肽引起痛敏，SP和CGRP的釋放可能是導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎疼痛的重要原因。

本實驗檢測了小鼠踝關(guān)節(jié)組織中SP和CGRP的釋放情況，結(jié)果顯示與control組相比，CFA誘導(dǎo)的model組小鼠痛敏反應(yīng)明顯增強(qiáng)，伴隨SP和CGRP濃度顯著增加，此結(jié)果與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致，SP和CGRP濃度與關(guān)節(jié)疼痛有聯(lián)系。CS處理的CS組和肥大細(xì)胞缺乏的W-4Bao組較model組神經(jīng)肽的釋放顯著減少，提示肥大細(xì)胞能夠調(diào)控小鼠踝關(guān)節(jié)組織中神經(jīng)肽的分泌，進(jìn)而影響關(guān)節(jié)炎疼痛的發(fā)生，這一過程可能和肥大細(xì)胞與關(guān)節(jié)神經(jīng)末梢之間的相互作用有關(guān)。

神經(jīng)免疫系統(tǒng)相互作用機(jī)制在多種疾病中已有報道，本實驗展示了CFA誘導(dǎo)的小鼠慢性AA使關(guān)節(jié)痛敏反應(yīng)增強(qiáng)，促進(jìn)了肥大細(xì)胞的活化和神經(jīng)肽的釋放；而肥大細(xì)胞缺乏的小鼠和使用肥大細(xì)胞穩(wěn)定劑處理過的小鼠能夠有效減輕關(guān)節(jié)炎癥，緩解關(guān)節(jié)疼痛，減少了神經(jīng)肽SP和CGRP的釋放，表明肥大細(xì)胞是促進(jìn)AA疼痛發(fā)生的重要中介，首次闡述了肥大細(xì)胞在關(guān)節(jié)炎疼痛中發(fā)揮重要作用，為治療RA疼痛提供了新的治療思路。然而肥大細(xì)胞與關(guān)節(jié)組織中傷害性感受神經(jīng)元之間具體的相互作用尚不清楚，它們之間是否存在著密切的聯(lián)系有待進(jìn)一步探討，以更加明確肥大細(xì)胞在關(guān)節(jié)疼痛中的作用機(jī)制，為尋找更明確的關(guān)節(jié)疼痛治療靶點提供更堅實的依據(jù)。