環(huán)狀RNA-42398通過(guò)調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞活化*

周玉平，呂雪幼，楊 萍 ，溫晉鋒，王慶領(lǐng)，葉國(guó)良

（寧波大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，2消化疾病研究所，浙江寧波315020；3寧波衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江寧波315100；4寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江寧波315211）

環(huán)狀 RNA（circular RNA，circRNA）是非編碼RNA研究領(lǐng)域的最新焦點(diǎn)之一，在闡明疾病發(fā)病機(jī)制及相關(guān)的診斷標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)方面，取得了重大進(jìn)展［1］。本課題組通過(guò)基因芯片技術(shù)初步分析了肝纖維化模型小鼠肝臟的circRNA表達(dá)譜變化，顯示mmu_circ_42398的表達(dá)變化差異最大（模型組比正常組降低了11.74倍），此外，在小鼠肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cells，HSC）活化模型中，mmu-circ-42398表達(dá)也顯著降低的［2］。本研究擬在此基礎(chǔ)上，圍繞肝星狀細(xì)胞活化這一肝纖維化最核心的細(xì)胞生物學(xué)事件，探討mmu_circ_42398對(duì)HSC活化的影響，并初步探討其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

材料和方法

1 材料和主要試劑

JS1小鼠肝星狀細(xì)胞株購(gòu)自深圳豪地華拓生物公司。胎牛血清和細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco；TRIzol購(gòu)自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒GoScript?Reverse Transcription Systemt和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒GoTaq?qPCR Master Mix購(gòu)自Promega；mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和對(duì)照空載質(zhì)粒由廣州吉賽生物科技公司提供；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自Invitrogen；RIPA裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；Protease Inhibitor Cocktail和Phosphatase Inhibitor Cocktail購(gòu)自Selleck。BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Thermo；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型膠原（collagen type I，Col I）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購(gòu)自Proteintech；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3抗體購(gòu)自Abcam。PCR及測(cè)序用小鼠引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 JS1細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 JS1細(xì)胞用10%FBS-DMEM培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合度傳代接種。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)時(shí)分成3組：正常對(duì)照組（control組）、空載體陰性對(duì)照組（vector組）和mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)組（mmu_circ_42398組）。

2.2 過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染JS1細(xì)胞 轉(zhuǎn)染前24 h，5×105個(gè)細(xì)胞接種在6孔板上，加入2 mL完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合達(dá)到70%～90%。在100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液加入3 μg質(zhì)粒，柔和混勻?；靹騆ipofectamine 2000試劑，用100 μL無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋4 μL Lipofectamine 2000試劑，輕輕混勻，室溫放置5 min。將稀釋好的質(zhì)粒和Lipofectamine 2000試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20 min。將200 μL質(zhì)粒-Lipofectamine 2000復(fù)合物加到含800 μL無(wú)血清培養(yǎng)液的細(xì)胞孔中，來(lái)回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板。細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)5～6 h后吸去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液，更換完全培養(yǎng)液。48 h后收集細(xì)胞。

2.3 RT-qPCR驗(yàn)證mmu_circ_42398過(guò)表達(dá) 提取細(xì)胞樣品總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qPCR檢測(cè)，分別以GAPDH和mmu_circ_42398特異引物進(jìn)行qPCR。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為20 μL，條件設(shè)置為：95℃ 10 min；95℃10 s，60℃ 60 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)設(shè)計(jì)測(cè)序引物，PCR后回收條帶測(cè)序驗(yàn)證環(huán)化位點(diǎn)接頭。每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

2.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 提取JS1細(xì)胞蛋白，BCA法定量，與SDS上樣緩沖液混合，95℃變性5 min。制膠，上樣，電泳，切膠，半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜。PBST洗膜3次，每次10 min，以5%BSA/PBS封閉1 h，加I抗（α-SMA、Col I、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3及 GAPDH），4℃輕搖孵育過(guò)夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加II抗（1∶5 000稀釋），室溫輕搖孵育1 h。進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光顯影，獲取條帶后ImageJ軟件分析灰度值，以GAPDH為內(nèi)參照計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染效果觀察

細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，熒光倒置顯微鏡下觀察，vector組和mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)組見(jiàn)大部分JS1細(xì)胞內(nèi)有綠色熒光表達(dá)，兩組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯異常，細(xì)胞轉(zhuǎn)染率達(dá)80%以上，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The JS1 cell transfection rate 48 h after transfection（scale bar=200 μm）.Most of JS1 cells had green fluorescent protein expression.圖1 熒光顯微鏡觀察mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染效果

2 mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)效果驗(yàn)證

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，mmu-circ-42398過(guò)表達(dá)組mmu_circ_42398的表達(dá)較vector組顯著增加（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行一代測(cè)序，確定其環(huán)化位點(diǎn)（backsplice site），并將其序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)circBase中的序列信息對(duì)比，結(jié)果一致，見(jiàn)圖2B。這一結(jié)果證明該cicrRNA確實(shí)為環(huán)狀RNA結(jié)構(gòu)，而非線性RNA結(jié)構(gòu)。

Figure 2.Verification of mmu_circ_42398 over expression.A：mmu_circ_42398 expression in JS1 cells was detected by RT-qPCR；B：the backsplice site of PCR products was verified by sequencing，and compared with that of circBase database.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs vector group.圖2 mmu_circ_42398的鑒定及過(guò)表達(dá)效果的驗(yàn)證

3 mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)抑制JS1細(xì)胞的活化

Western blot結(jié)果顯示，mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)組的α-SMA及Col I的蛋白表達(dá)較vector組顯著降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3。

4 mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的影響

Western blot結(jié)果顯示，與vector組比較，mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)組的p-Smad2和p-Smad3蛋白水平顯著降低（P＜0.01），TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化，見(jiàn)圖4。

討 論

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化、肝癌、肝衰竭方向發(fā)展的共同病理階段，一直是肝病研究的重點(diǎn)領(lǐng)域。HSC的活化是促進(jìn)肝纖維化持續(xù)發(fā)展的重要因素［3］，抑制HSC的活化被認(rèn)為是抗肝纖維化的有效途徑［4］。TGF-β1/Smads信號(hào)通路在HSC的激活、組織纖維化發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到了關(guān)鍵性作用［5］。當(dāng)TGF-β1與其位于HSC胞膜的受體（TGF-β1 receptor，TβR）結(jié)合并使TβR活化，與TβR結(jié)合的RSmads（包括Smad2和Smad3）就會(huì)被磷酸化而激活，Smad2/3是TβR-I受體的特異性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，磷酸化的R-Smads與Smad4形成多聚復(fù)合物，穿過(guò)核膜進(jìn)入細(xì)胞核，在其他轉(zhuǎn)錄因子的協(xié)同下，參與不同目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄［6］，Smad7是該信號(hào)通路中最重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)蛋白［7］。調(diào)控TGF-β1/Smads信號(hào)通路被認(rèn)為是干預(yù)HSC活化和肝纖維化的重要策略。

circRNA是當(dāng)前非編碼RNA研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)，最近的兩項(xiàng)研究報(bào)道顯示，circRNA可能影響HSC的活化：Chen等［8］分析了放射線誘導(dǎo)的人肝星狀細(xì)胞株LX-2活化模型的circRNA差異表達(dá)譜，并進(jìn)一步證實(shí)了hsa_circ_0071410可通過(guò)“miRNA海綿作用”結(jié)合miR-9-5p，從而影響HSC的活化；Wang等［9］的研究顯示患者血清CircMTO1表達(dá)水平與肝纖維化疾病進(jìn)展顯著負(fù)相關(guān)，通過(guò)體外細(xì)胞模型進(jìn)一步證實(shí)了CircMTO1可通過(guò)結(jié)合miR-17-5p，提高Smad7的表達(dá)水平，從而抑制肝纖維化進(jìn)展。本課題組前期通過(guò)小鼠肝纖維化模型和肝細(xì)胞株JS1體外活化模型，篩選出mmu_circ_42398可能影響肝星狀細(xì)胞的活化。本研究通過(guò)構(gòu)建mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)染到JS1細(xì)胞中，觀察到星狀細(xì)胞活化標(biāo)志物即α-SMA及Col I蛋白表達(dá)顯著減少，說(shuō)明mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)能顯著抑制HSC的活化。課題組進(jìn)一步從TGF-β1/Smads信號(hào)通路的角度探討了其可能的機(jī)制，結(jié)果顯示，mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)組JS1細(xì)胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白水平顯著降低，但TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表達(dá)量無(wú)顯著變化。上述結(jié)果提示，mmu_circ_42398過(guò)表達(dá)能顯著抑制R-Smads的磷酸化，從而抑制細(xì)胞內(nèi)TGF-β1/Smads信號(hào)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，這是其抑制HSC活化的作用機(jī)制之一。

此前，我們通過(guò)生物信息學(xué)分析，顯示mmu_circ_42398表面存在miR-338-3p的反應(yīng)元件（microRNA response element，MRE），能特異性結(jié)合miR-338-3p［10］。最近的一項(xiàng)雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示miR-338-3p能直接與骨成形蛋白-激活素膜結(jié)合阻斷因子（BMP and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）結(jié)合，降低 BAMBI活性，從而激活TGF-β/Smads信號(hào)通路［11］。BAMBI是 TGF-β/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的偽受體，與TGF-βⅠ型受體結(jié)構(gòu)相似，但不具有同樣的活性，它可以競(jìng)爭(zhēng)性地與TGF-βⅡ型受體結(jié)合，BAMBI由于缺乏胞內(nèi)區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域而不能磷酸化，導(dǎo)致胞質(zhì)區(qū)的Smad蛋白無(wú)法被磷酸化激活，從而阻斷TGF-β家族的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［12］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，mmu_circ_42398的過(guò)表達(dá)對(duì)TGF-β1本身表達(dá)并無(wú)影響，僅是降低了Smads蛋白的磷酸化水平，上述結(jié)果提示，mmu_circ_42398可能通過(guò)“miRNA海綿作用”靶向結(jié)合miR-338-3p，提高了BAMBI表達(dá)水平，從而進(jìn)一步抑制Smads蛋白的磷酸化水平，最終抑制了HSC的活化。