重組人血清白蛋白-硫氧還蛋白融合蛋白對(duì)流感病毒所致急性肺損傷小鼠的保護(hù)作用*

付南燕，徐 娟，韓曉群

（宜春學(xué)院醫(yī)學(xué)院 1病原生物學(xué)教研室，2生理學(xué)教研室，江西宜春336000）

感染流感病毒可導(dǎo)致多種疾病，如急性肺損傷（acute lung injury，ALI），其具有較高的發(fā)病率和死亡率［1］。研究表明，氧化應(yīng)激在流感引起的ALI的發(fā)生和發(fā)展中起著重要的作用［2-3］。硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx）是一種小型氧化還原蛋白（12 kD），廣泛存在于人體中，是多種氧化應(yīng)激條件下誘導(dǎo)的防御蛋白之一［4］。然而，Trx血漿半衰期在小鼠中僅為1 h左右，在大鼠中僅為2 h［5-6］，為了獲得滿(mǎn)意的治療結(jié)果，需要保持一定的Trx治療濃度。為了增加Trx在血液中的保留時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了一種由人血清白蛋白（human serum albumin，HSA）和Trx組成的基因重組融合蛋白HSATrx［7］。研究表明，在正常小鼠中 HSA-Trx融合蛋白的血漿半衰期與HSA相似，是Trx自身血漿半衰期的10 倍，此外，HSA-Trx在肺中的分布高于 Trx［7］。因此，本研究旨在探討HSA-Trx對(duì)流感所致ALI小鼠的影響。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

60只SPF級(jí)5周齡健康雄性ICR小鼠，體重（31±1）g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK（滬）2016-0002；小鼠于12 h/12 h明暗循環(huán)、25℃和濕度（50±5）%的環(huán)境中，接受標(biāo)準(zhǔn)攝食和飲水，自適應(yīng)飼養(yǎng)1周。

2 主要試劑

藍(lán)色瓊脂糖凝膠6FF、HiTrap Phenyl HP柱和PD-10脫鹽柱（GE Healthcare）；Diff-Quick試劑（Solarbio）；考馬斯亮藍(lán)染色液、4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（4，6-diamino-2-phenylindole，DAPI）和干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）ELISA試劑盒（BioLegend）；水合氯醛、4%甲醛、Mayer蘇木精溶液和1%伊紅醇溶液（Sigma）；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）、8-羥基脫氧鳥(niǎo)苷（8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG）抗體（Santa Cruz）；3-硝基酪氨酸（3-nitrotyrosine，NO2-Tyr）抗體（Millipore）。

3 方法

3.1 HSA-Trx融合蛋白的產(chǎn)生 利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)了基因重組融合蛋白HSA-Trx［7］。將轉(zhuǎn)化后的巴斯德畢赤酵母細(xì)胞在1.25 L BMGY液體培養(yǎng)基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀（pH 6.0），1.34%硫酸銨作為酵母氮源（無(wú)氨基酸），0.000 04%生物素，1%甘油］（增長(zhǎng)階段）中培養(yǎng)2 d（A600=2），然后在30°C含有蛋白表達(dá)誘導(dǎo)劑和甲醇碳源的800 mL BMMY培養(yǎng)基［1%酵母提取物，2%蛋白胨，100 mmol/L磷酸鉀（pH 6.0），1.34%硫酸銨作為酵母氮源（無(wú)氨基酸），0.000 04%生物素，1%甲醇］（蛋白質(zhì)誘導(dǎo)階段）中培養(yǎng)3 d。每隔12 h加入甲醇，使甲醇濃度保持在1%，以維持蛋白表達(dá)誘導(dǎo)效應(yīng)。融合蛋白在藍(lán)色瓊脂糖凝膠6FF柱上用200 mmol/L醋酸鈉緩沖液（pH 5.5）進(jìn)行色譜純化，透析后在相同緩沖液上平衡。采用蛋白純化儀，5 mL Hi-Trap Phenyl HP柱上進(jìn)行疏水層析，采用以下條件：緩沖液A：50 mmol/L Tris-HCl/1.5 mol/L硫酸銨（pH 7.0）；緩沖液B：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）；梯度：0～100%緩沖液B 100 mL；流速：3 mL/min。融合蛋白在10%聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE分析，考馬斯亮藍(lán)R250染色。該融合蛋白的純度可達(dá)97%以上。

3.2 ALI小鼠模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 本實(shí)驗(yàn)使用的小鼠H1N1流感病毒PR8株（A/Puerto Rico/8/1934）由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物研究所提供，-80℃保存。將小鼠隨機(jī)分為4組：健康對(duì)照（control）組、ALI組、ALI+Trx組和ALI+HSA-Trx組，每組10只。除健康對(duì)照組外，其余處理組小鼠在第0天使用水合氯醛（500 mg/kg）麻醉，流感病毒懸液鼻內(nèi)接種，劑量為1.5×LD50（用LB培養(yǎng)液稀釋流感病毒懸液），建立流感誘導(dǎo)的ALI小鼠模型。Trx或HSA-Trx組在病毒感染后第4天和第6天經(jīng)小鼠尾靜脈注射Trx或HSATrx（每只小鼠3.5 nmol蛋白，溶于200 μL生理鹽水中），健康對(duì)照組和ALI組小鼠注射200 μL生理鹽水。分別于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)處死小鼠，其中第0天于感染后2 h處死小鼠取材，進(jìn)行療效評(píng)價(jià)。生存率分析另外取小鼠進(jìn)行ALI組和ALI+HSA-Trx組實(shí)驗(yàn)，從病毒感染第0～14天，每組10只，這些小鼠未測(cè)量其它參數(shù)。

3.3 肺灌洗樣本分析 乙醚麻醉小鼠，打開(kāi)胸腔，取血測(cè)定過(guò)氧化物（見(jiàn)下文）。氣管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的無(wú)菌PBS灌肺（2次），收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar larage fluid，BALF）。每只小鼠體內(nèi)提取約1.8 mL BALF，混勻后取0.5 mL用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)算細(xì)胞總數(shù)。剩余BALF離心（250×g、10 min、4°C），棄上清液，在 0.9%NaCl中重懸細(xì)胞，用Diff-Quick試劑染色細(xì)胞，測(cè)定肺泡中性粒細(xì)胞數(shù)量。以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)溶液法測(cè)定BALF中的蛋白濃度。采用ELISA法測(cè)定BALF中IFN-γ的含量。

3.4 肺組織的病理學(xué)檢查 將肺組織固定于4%甲醛，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色，觀察病理學(xué)變化，采用免疫熒光法檢測(cè)iNOS、8-OhdG和NO2-Tyr。采用HistoVT One進(jìn)行抗原檢索，用含有50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）和0.1%吐溫 20（T-TB）的溶液對(duì)肺切片進(jìn)行溶解，在25℃用下BlockAce封閉15 min，加入I抗，4℃下過(guò)夜。此外，使用前用0.5%BSA在PBS中稀釋?zhuān)?∶50）I抗，并與DAPI溶液（10 g/L）偶聯(lián)。用T-TB沖洗肺切片，25℃下與II抗反應(yīng)1.5 h。iNOS和NO2-Tyr免疫染色采用Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H+L）（Invitrogen），8-OHdG免疫染色采用Alexa Fluor 555山羊抗小鼠IgG（H+L）（Invitrogen），使用前在PBS中用0.5%BSA稀釋?zhuān)?∶2 000）。反應(yīng)后，在顯微鏡下觀察切片。利用ImageJ軟件對(duì)iNOS、8-OHdG和NO2-Tyr免疫熒光染色的程度和強(qiáng)度進(jìn)行圖像分析。

3.5 血漿過(guò)氧化物水平的測(cè)定 于腹主動(dòng)脈采血3 mL，并立即于 4℃、1 000×g離心 15 min，收集血漿，-80℃保存。使用CR2000RC分析儀測(cè)量血漿中過(guò)氧化物濃度。測(cè)量單位為U.CARR（Carratelli unit；1 U.CARR相當(dāng)于0.8 mg/L過(guò)氧化氫）。

3.6 肺組織病毒載量測(cè)定 取流感病毒感染小鼠的左肺，稱(chēng)重，在1 mL RPMI-1640培養(yǎng)基中進(jìn)行勻漿處理，100×g、4℃離心10 min，取上層清液，通過(guò)Madin-Darby犬腎（Madin-Darby canine kidney，MDCK）細(xì)胞空斑形成實(shí)驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。將MDCK細(xì)胞接種于24孔板上，培養(yǎng)至融合。PBS沖洗，每次稀釋0.1 mL接種至培養(yǎng)細(xì)胞，34℃孵育1 h。每孔加入DMEM 0.5 mL（含青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L和兩性霉素B 0.5 mg/L），在5%CO2、37℃加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d。計(jì)算病毒斑，采用Reed和Muench公式計(jì)算50%組織培養(yǎng)感染劑量（median tissue culture infectious dose，TCID50）［8］。

3.7 FITC標(biāo)記HSA-Trx評(píng)價(jià)其在流感病毒感染小鼠BALF中的分布 HSA-Trx（4 g/L）和FITC（1 g/L）溶于0.15 mol/L K2HPO4（pH 9.5）中，室溫下混合4 h，經(jīng)PD-10脫鹽柱脫鹽，洗脫液用Vivapore濃縮。病毒感染后第4天和第6天給模型小鼠靜脈注射FITC標(biāo)記的HSA-Trx（每只3.5 nmol），正常小鼠第0天給藥，2 h后，用乙醚麻醉小鼠，打開(kāi)胸腔，抽肺內(nèi)干血液。氣管插管，用1 mL含5×104U/L肝素的無(wú)菌PBS灌肺，收集BALF。每只小鼠體內(nèi)提取約0.8 mL BALF。BALF在250×g、4℃離心10 min，將BALF中的細(xì)胞從液體中分離出來(lái)，采用分光光度計(jì)檢測(cè)BALF中FITC標(biāo)記的HSA-Trx含量。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）。使用GraphPad Prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。單因素方差分析（one-way ANOVA）和Bonferroni多重比較分析各組間的差異。使用Kaplan-Meier對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)分析生存曲線(xiàn)。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠體重及存活率的影響

氣管內(nèi)注射1.5×LD50劑量流感病毒可引起小鼠急性肺損傷，BALF中的總細(xì)胞數(shù)增加、中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和總蛋白含量升高在病毒感染后的第4～6天發(fā)生，見(jiàn)圖1A～C。此外，流感病毒感染后病毒載量在第4天達(dá)到高峰后下降，見(jiàn)圖1D。

ALI組小鼠的體重從病毒感染后第6天開(kāi)始下降，病毒感染后第14天，僅20%小鼠存活，而HSATrx給藥顯著抑制了病毒感染小鼠體重的下降（P＜0.05），在病毒感染后14天，70%的HSA-Trx治療小鼠仍然存活，存活率顯著高于ALI組小鼠（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

2 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠損傷的相對(duì)抑制作用

HSA-Trx處理小鼠后其BALF中總細(xì)胞數(shù)顯著低于ALI組和Trx組的小鼠，中性粒細(xì)胞數(shù)顯著低于ALI組小鼠（P＜0.05），見(jiàn)圖3A、B，HSA-Trx顯著降低了ALI小鼠BALF中的蛋白濃度（P＜0.05），而Trx對(duì)降低BALF蛋白濃度沒(méi)有顯著作用（P＞0.05），見(jiàn)圖3C。

HE染色的肺切片顯示，與ALI組相比，HSA-Trx處理后肺切片的損傷程度有所減輕（P＜0.05），Trx處理組肺切片的組織病理學(xué)結(jié)果與ALI組相似，見(jiàn)圖3D。

3 HSA-Trx對(duì)BALF中IFN-γ水平及肺中iNOS表達(dá)的影響

與健康對(duì)照組相比，ALI組小鼠的IFN-γ和iNOS表達(dá)水平升高（P＜0.05），而HSA-Trx處理后與ALI組之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05），見(jiàn)圖4。

4 HSA-Trx對(duì)肺組織氧化應(yīng)激的影響

與健康小鼠相比，流感病毒感染小鼠肺組織中8-OHdG和NO2-Tyr表達(dá)及血漿過(guò)氧化物水平均升高（P＜0.01），而HSA-Trx則顯著抑制了這些氧化應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

5 在流感病毒感染小鼠BALF中FITC標(biāo)記的HSA-Trx的分布

Figure 1.Evaluation of influenza virus-induced ALI model mice（0，2，4，6 and 8 days after viral infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：viral titers in lung tissues.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.圖1 流感病毒誘導(dǎo)的ALI模型小鼠的評(píng)估

Figure 2.Effect of HSA-Trx on body weight（A）and survival rate（B）of mice infected with influenza virus.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.圖2 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠體重和生存率的影響

第6天FITC標(biāo)記的HSA-Trx在BALF的分布大約是正常小鼠第0天的4倍（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

討 論

Trx對(duì)氧化應(yīng)激相關(guān)或炎癥相關(guān)的肺部疾病具有有效作用［9］，流感病毒感染是造成肺炎的原因，并伴有ALI等并發(fā)癥，可能導(dǎo)致死亡［1］。本研究表明HSA-Trx對(duì)流感病毒所致的ALI小鼠有一定保護(hù)作用。本研究利用甲型流感病毒H1N1誘導(dǎo)ALI，且在流感病毒感染后的病毒載量在第4天達(dá)到峰值，然后下降。因此，HSA-Trx在病毒感染后第4和6天用，顯著降低了小鼠死亡率。結(jié)果與以前的報(bào)道一致［9］，該研究中重組蛋白Trx-1提高了病毒感染小鼠的存活率。BALF中總蛋白的增加可以評(píng)估感染引起的ALI的嚴(yán)重程度［10］，本研究中HSA-Trx顯著降低了ALI小鼠BALF中流感病毒誘導(dǎo)的總蛋白含量，而Trx則沒(méi)有顯示出療效。此外，從病理學(xué)上證實(shí)了HSA-Trx改善了小鼠H1N1誘導(dǎo)的肺損傷。與本研究結(jié)果類(lèi)似，Trx對(duì)博來(lái)霉素誘導(dǎo)的肺損傷沒(méi)有顯示有效的保護(hù)作用［11］。因此，HSA-Trx的保護(hù)作用可能是與其在血液中滯留的時(shí)間延長(zhǎng)有關(guān)［5-6］。

Figure 3.Relative inhibition of HSA-Trx in mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：total cells in BALF；B：neutrophils in BALF；C：protein concentration in BALF；D：lung histopathology（HE staining，scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs ALI group.圖3 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠肺損傷的作用

Figure 4.Effect of HSA-Trx on IFN-γ levels in BALF and expression of iNOS in lung tissue of mice infected with influenza virus（8 days after virus infection）.A：IFN-γ levels in BALF；B：iNOS/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）.Mean±SD.n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖4 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠BALF中IFN-γ水平和肺組織中iNOS表達(dá)的影響

Figure 5.Effect of HSA-Trx on oxidative stress in mice infected with influenza virus.A：8-OHdG/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；B：NO2-Tyr/DAPI immunofluorescence in lung tissue sections（scale bar=100 μm）；C：plasma peroxide levels.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs ALI group圖5 HSA-Trx對(duì)流感病毒感染小鼠氧化應(yīng)激的影響

研究表明，流感病毒感染導(dǎo)致BALF中產(chǎn)生了大量IFN-γ，從而導(dǎo)致肺泡巨噬細(xì)胞、支氣管和肺泡上皮細(xì)胞中iNOS表達(dá)上調(diào)［12］。但本研究中HSA-Trx并不能降低因病毒感染而產(chǎn)生的IFN-γ和iNOS表達(dá)水平。其他研究表明，活化的白細(xì)胞，尤其是肺泡巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞釋放的ROS與流感誘導(dǎo)的ALI有關(guān)［2］。研究還顯示BALF中的中性粒細(xì)胞濃度與肺部疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［13］。本研究中HSA-Trx對(duì)病毒感染引起的中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)有顯著的抑制作用。事實(shí)上，中性粒細(xì)胞在流感病毒感染后到達(dá)肺泡，與白細(xì)胞（例如肺泡巨噬細(xì)胞）結(jié)合。此外，iNOS釋放的NO與活化的白細(xì)胞生成的·O2-反應(yīng)可以產(chǎn)生具有強(qiáng)損傷活性的ONOO-，ONOO-可以硝化多種生物靶點(diǎn)，如蛋白質(zhì)和脂肪酸，產(chǎn)生NO2-Tyr加合物［14］。本研究中HSA-Trx顯著抑制了肺組織中8-OHdG和NO2-Tyr的表達(dá)及血漿過(guò)氧化物這些氧化應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)。此外，研究報(bào)道Trx通過(guò)抑制p38絲裂原活化蛋白激酶活化、L-選擇素下調(diào)和內(nèi)皮細(xì)胞粘附，對(duì)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生抗趨化作用［5］。因此，HSA-Trx對(duì)流感誘導(dǎo)ALI的改善作用機(jī)制不僅與抗氧化作用有關(guān)，可能還涉及到抗趨化作用。

肺泡液體中白蛋白的濃度通常遠(yuǎn)低于血液中，然而在肺損傷的情況下，由于表面活性劑表面張力顯著升高而導(dǎo)致血管高通透性，蛋白濃度可增加到血漿水平的75%～95%［15］。因此，BALF中白蛋白濃度在臨床上被用作肺損傷的生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明HSA-Trx可明顯降低流感病毒感染小鼠的BALF中蛋白的濃度。

Figure 6.Distribution of FITC-labeled HSA-Trx in BALF of influenza virus-infected mice.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs day 0.圖6 FITC標(biāo)記的HSA-Trx在流感病毒感染小鼠BALF中的分布

綜上所述，HSA-Trx是一種持久的抗氧化劑和抗炎調(diào)節(jié)劑，其給藥后能抑制流感病毒誘導(dǎo)的ALI，其機(jī)制可能是其抗氧化和抗趨化的共同作用，另外HSA-Trx在病變部位的分布有所不同，即在流感感染者肺間質(zhì)的分布可能高于健康人。因此，HSA-Trx治療流感病毒引起的肺炎可能具有相當(dāng)大的潛力。