槲皮素通過上調(diào)SIRT1降低心肌缺血/再灌注微血管通透性*

劉振華，張艷紅，董 杰，韓麗萍

（溫州醫(yī)科大學(xué)低氧醫(yī)學(xué)研究所，浙江溫州325035）

急性心肌梗死是威脅人類健康的難治性疾病之一，其治療宗旨是盡早再通阻塞的血管以恢復(fù)缺血組織的供血，即再灌注［1］。但是血管成功再通后，仍有患者出現(xiàn)梗死面積擴(kuò)大、心功能惡化以及梗死心室重塑加重的現(xiàn)象［2］，這說明再灌注雖然緩解了心肌缺血的狀況，卻使單純?nèi)毖鸬膿p傷惡化，導(dǎo)致心肌代謝紊亂、心肌超微結(jié)構(gòu)改變、心律失常以及舒縮功能障礙等，即心肌缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷［3］。目前的研究較多關(guān)注是恢復(fù)心肌細(xì)胞的血供及如何保護(hù)心肌細(xì)胞等方面，而給細(xì)胞提供血液的微血管本身的損傷和作用卻被忽視了［4］。心肌I/R時微血管損傷（microvascular damage，MVD）的病理生理后果主要體現(xiàn)在微血管阻塞（即無復(fù)流現(xiàn)象）和微血管屏障功能喪失（即微血管的通透性增高）兩個方面［5］。槲皮素（quercetin，Que）可顯著抑制多核粒細(xì)胞和過氧化氫的聚集，降低離體培養(yǎng)的人心臟毛細(xì)血管前微動脈的通透性，關(guān)閉開放的緊密連接，抑制內(nèi)皮細(xì)胞的肌動蛋白系統(tǒng)［6］，提示槲皮素可能具有減少I/R時微血管漏出的作用。且研究證實，槲皮素可以上調(diào)沉默信息調(diào)控因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的表達(dá)。SIRT1屬于sirtuins家族的成員，是NAD+依賴的表觀遺傳和代謝調(diào)節(jié)因子，可以去乙?；艘蜃应蔅（nuclear factor-κB，NF-κB）的亞單位Rel A/p65，抑制其轉(zhuǎn)錄，減少 NF-κB刺激線粒體產(chǎn)生的氧自由基，從而發(fā)揮抗炎和抗氧化的作用［7］。因此，本論文擬驗證槲皮素是否可以通過激動SIRT1減輕微血管損傷進(jìn)而緩解大鼠心肌I/R損傷。

材料和方法

1 實驗動物

雄性SD大鼠，體重220～250 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，合格證號SCXK（浙）2016-0011。動物生活環(huán)境恒溫（23±2）℃，常規(guī)24 h晝夜循環(huán)。

2 細(xì)胞和試劑

小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞系5（H5V）購自舜冉（上海）生物技術(shù)公司。槲皮素（Sigma）；選擇性SIRT1抑制劑EX527（MedChem Express）；抗SIRT1抗體（Proteintech）；抗ZO-1、肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase，MLCK）和肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）抗體（Abcam）；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；E-選擇素（E-selectin）、血管細(xì)胞黏附分子1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、血小板活化因子（platelet-activating factor，PAF）、白細(xì)胞介素1α（interleukin-1α，IL-1α）和IL-6的 ELISA檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

3 實驗方法

3.1 在體心肌缺血/再灌注模型的建立 成年SD大鼠稱重，腹腔注射7%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉，固定于手術(shù)臺上。肢體末端皮下插入心電電極，術(shù)中連續(xù)監(jiān)測心電圖。剪開氣管進(jìn)行氣管插管，連接動物呼吸機(jī)。剃毛開胸以暴露心臟，剪開心包，于冠狀動脈左室前降支離左心耳下緣約0.15 cm處繞左室支穿線結(jié)扎，缺血30 min后松開活結(jié)，拔去引線，再灌注60 min。以ST段明顯抬高為結(jié)扎成功（心肌缺血）的指標(biāo)，剪開結(jié)扎線后ST段下降1/2以上表明復(fù)灌成功。假手術(shù)（sham）組只穿線不結(jié)扎，I/R組缺血30 min／再灌注60 min，Que+I/R組于再灌注前15 min尾靜脈注射Que（10 mg/kg），Que+EX527+I/R組于再灌注前15 min和30 min分別尾靜脈注射Que（10 mg/kg）和EX527（1 mg/kg）。

3.2 大鼠心電圖采集 使用RM6240系列多道生理信號采集處理系統(tǒng)采集心電圖信息。手術(shù)全程記錄心電圖變化，分析計數(shù)各組再灌注后室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）、室性纖維顫動（ventricular fibrillation，VF）、室性異位節(jié)律（ventricular ectopic beats，VEBs）及房室傳導(dǎo)阻滯（atrial ventricular block，AVB）的發(fā)生率和心律失常的持續(xù)時間。

3.3 心肌組織HE染色 大鼠心臟取材后，以4%多聚甲醛固定24 h，再經(jīng)石蠟包埋做成5 μm切片，切片使用二甲苯脫蠟以及各級乙醇至水洗環(huán)節(jié)后，使用蘇木精及伊紅（HE）染色5～15 min，常規(guī)清洗、脫水、封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察心臟組織學(xué)變化。

3.4 ELISA檢測血漿PAF、IL-1α和IL-6水平 缺血再灌注60 min后，從大鼠頸總動脈取2 mL血于促凝管中，1 000×g離心20 min，取上清液分裝于EP管中，-80℃保存以備檢測用。ELISA具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行，通過酶標(biāo)儀讀取數(shù)據(jù)。

3.5 單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性的檢測 將小鼠H5V細(xì)胞接種于Transwell頂層小室，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2加95%O2常規(guī)培養(yǎng)，至細(xì)胞生長鋪滿后開始建立缺氧/復(fù)氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）模型，即將培養(yǎng)液換成低糖DMEM培養(yǎng)基并加入 200 μmol/L CoCl2，于 37℃、5%CO2+95%N2孵箱中培養(yǎng)6 h后，棄去含CoCl2的培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，再換成不含CoCl2的正常培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)1 h。復(fù)氧的同時于頂層小室加入大分子熒光標(biāo)記物FITC-dextran（Sigma）檢測內(nèi)皮通透性。實驗分為4組：對照（control）組、H/R組、Que（20 μmol/L）+H/R組和Que+EX527（5 μmol/L）+H/R組。

3.6 免疫熒光檢測ZO-1的表達(dá) 將細(xì)胞接種于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞爬片，按上述分組處理后，1%多聚甲醛固定，5%小牛血清封閉1 h，加入稀釋好的熒光Ⅰ抗（抗ZO-1抗體）4℃過夜，PBS洗3次，避光加入稀釋好的熒光Ⅱ抗室溫孵育1 h。PBS洗3次，DAPI染核15 min，用抗熒光淬滅劑封片。

3.7 Western blot檢測蛋白表達(dá) 分別收集心肌組織和培養(yǎng)于6孔板的細(xì)胞，按比例加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。每個樣本取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。5%脫脂奶粉于室溫封閉1h后，加入稀釋好的Ⅰ抗（抗SITR1抗體、抗MLCP抗體、抗ZO-1抗體和抗β-actin抗體）4℃搖床孵育過夜。洗膜4次后，將膜與稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的Ⅱ抗在室溫輕搖1 h，洗膜后加顯影液顯影、定影、掃描。

3.8 H5V細(xì)胞骨架形態(tài)的檢測 將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞爬片，按上述分組藥物處理完成后，棄去培養(yǎng)液，1%多聚甲醛固定，5%小牛血清封閉1 h，加入稀釋好的鬼筆環(huán)肽染料室溫孵育1 h，PBS洗3次，DAPI染核15 min，用抗熒光淬滅劑封片。Nikon倒置熒光顯微鏡拍照，檢測羅丹明標(biāo)記的紅色熒光，不同組間成像系統(tǒng)參數(shù)設(shè)置一致。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用SPSS 20.0和GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，兩組間比較用獨立樣本t檢驗，多組樣本比較選用單因素方差（one-way ANOVA）分析，組間差異的兩兩比較選用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 槲皮素減少大鼠I/R后心律失常的發(fā)生

手術(shù)心電圖監(jiān)測結(jié)果顯示，sham組大鼠心電圖ST段無明顯變化，I/R組大鼠心電圖在心肌缺血時ST段明顯抬高，在再灌注期間ST段又有明顯的回落，說明心臟缺血/再灌注模型制備成功，見圖1。心律失常統(tǒng)計結(jié)果表明，I/R組大鼠再灌注過程中，VT和VEB等心律失?，F(xiàn)象均有發(fā)生，而Que+I/R組大鼠心肌再灌注性心律失常發(fā)生率顯著降低，持續(xù)時間縮短（P＜0.05）；與Que+I/R組相比，Que+EX527+I/R組的VT和VEB等心律失?，F(xiàn)象發(fā)生的概率也有明顯的升高（P＜0.05），見表1。

Figure 1.Real-time ECG during whole surgery of I/R.圖1 實時監(jiān)測I/R手術(shù)全程心電圖的變化

表1 各組心律失常發(fā)生率比較Table 1.Comparison of arrhythmia incidence among the 4 groups（n=10）

2 槲皮素改善缺血/再灌注心肌組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)

HE染色顯示，sham組大鼠心肌纖維排列整齊，心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，大小、形態(tài)一致，邊緣清晰，無細(xì)胞水腫及變性壞死出現(xiàn)，微血管完整；I/R組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)明顯變性壞死，廣泛水腫及大量炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞結(jié)構(gòu)排列不規(guī)則，細(xì)胞間隙明顯增大，部分區(qū)域心肌纖維組織出現(xiàn)缺失和斷裂，微血管被破壞；與I/R組比較，Que可明顯減輕心肌組織病理改變，Que+I/R組心肌纖維排列較為整齊，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，間質(zhì)輕度水腫及散在炎細(xì)胞浸潤；Que+EX527+I/R組大鼠心肌組織仍可見局部心肌纖維排列纖紊亂或斷裂，間質(zhì)有較為明顯水腫及炎性細(xì)胞浸潤，見圖2。

Figure 2.The morphological changes of the myocardium（HE staining，×40）.圖2 各組心肌形態(tài)學(xué)改變

3 ELISA測定大鼠外周血血清E-選擇素和多種促炎因子的變化

Sham組血中E-選擇素含量較低，發(fā)生I/R損傷后，其含量明顯增加（P＜0.05）；使用槲皮素干預(yù)后，E-選擇素含量與I/R組相比有了明顯的降低（P＜0.05）；而在Que+EX527+I/R組中，E-selectin的含量較Que+I/R組顯著上升，見圖3。

Figure 3.The content of E-selectin in peripheral blood of each group was detected by ELISA.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖3 ELISA檢測各組外周血中E-選擇素的含量

Sham組VCAM-1、PAF、IL-1α和IL-6的含量均較低，發(fā)生I/R損傷后，上述促炎因子的含量明顯增加（P＜0.05）；使用槲皮素干預(yù)后，其含量和I/R組相比有了明顯的降低（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，PAF、VCAM-1、IL-1α和IL-6的含量較Que+I/R組明顯回升，見圖4。

4 槲皮素降低單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性

FITC熒光值測定Transwell小室中培養(yǎng)的單層內(nèi)皮細(xì)胞通透性，結(jié)果顯示H/R組的熒光值與sham組相比顯著增高（P＜0.05）；Que+H/R組的熒光值較H/R組顯著降低，加入EX527后，這種熒光值又明顯升高（P＜0.05），見圖5。

5 槲皮素上調(diào)缺血/再灌注心肌組織SIRT1蛋白的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與sham組相比，I/R組的SIRT1表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；而Que+I/R組的SIRT1表達(dá)水平則較I/R組顯著增高（P＜0.05），但加入EX527后，SIRT1蛋白的表達(dá)水平較Que+I/R組降低，見圖6。

6 槲皮素上調(diào)H/R后H5V細(xì)胞ZO-1和MLCP的表達(dá)

Western blot和免疫熒光，結(jié)果顯示H/R后ZO-1的表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；使用槲皮素干預(yù)后，ZO-1表達(dá)量與H/R組相比有了明顯的回升（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，沒有出現(xiàn)ZO-1表達(dá)量回升的現(xiàn)象，見圖7和圖8。Western blot法檢測結(jié)果顯示，H/R后的H5V細(xì)胞的MLCP表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；使用槲皮素干預(yù)后，MLCP的表達(dá)量與H/R組相比有了明顯的回升（P＜0.05）；而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，沒有出現(xiàn)MLCP表達(dá)量回升的現(xiàn)象，見圖7。

7 槲皮素減少H/R后細(xì)胞骨架的重排

Figure 4.The content of proinflammatory factors in peripheral blood of each group were measured by ELISA.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖4 ELISA檢測各組外周血中促炎因子的含量

Figure 5.The permeability of monolayer endothelial cells was evaluated by Transwell assay.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs H/R group；△P＜0.05 vs Que+H/R group.圖5 Transwell實驗檢測單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透性

H/R誘導(dǎo)損傷后，H5V細(xì)胞的肌動蛋白排列紊亂，極性消失，細(xì)胞間縫隙增大。槲皮素干預(yù)后，肌動蛋白恢復(fù)規(guī)則排列。而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，其排列與H/R組比較，未見明顯改善，見圖9。

討 論

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重的心血管疾病，其發(fā)病機(jī)制是心臟冠狀動脈的急性閉塞引起的心肌血液供應(yīng)快速的減少或中斷。急性心肌梗塞最有效的治療方法就是恢復(fù)冠狀動脈的血液流動，但這種治療方法會導(dǎo)致再灌注損傷，所以對再灌注損傷的研究及防治逐漸被研究者重視［8］。開發(fā)在緩解缺血性損傷的同時也能保護(hù)機(jī)體免受再灌注損傷的藥物是相當(dāng)重要的，這也一直是研究的重點。

SIRT1是沉默信息調(diào)節(jié)因子2的酵母同源物，通過脫乙?；M蛋白和非組蛋白調(diào)節(jié)線粒體凝聚和基因轉(zhuǎn)錄。它還可以調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞存活和線粒體功能，參與代謝綜合征和動脈粥樣硬化相關(guān)血管疾病的多種病理生理過程，已有研究指出SIRT1將是人類心血管相關(guān)疾病的一個重要治療靶點［9］。大鼠在體實驗結(jié)果表明槲皮素可以減輕大鼠心肌I/R過程中微小血管損傷，同時SIRT1的表達(dá)也升高。體外實驗進(jìn)一步證實了槲皮素可以上調(diào)SIRT1，并減少心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞H5V發(fā)生H/R時的細(xì)胞通透性。

在I/R損傷的過程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子會與中性粒細(xì)胞結(jié)合，大量炎癥因子被中性粒細(xì)胞釋放，這些炎癥因子又會引起血液中其他的中性粒細(xì)胞積聚，這種效應(yīng)級聯(lián)放大，最終會引起血管內(nèi)皮細(xì)胞的收縮，血管壁通透性增加，這是造成多種血管功能障礙及組織損傷的機(jī)制之一［10］。本實驗ELISA結(jié)果表明，與sham組相比，I/R組外周血中內(nèi)皮損傷標(biāo)志物E-選擇素和VCAM-1及炎癥因子PAF、IL-1α和IL-6的含量明顯增加，槲皮素干預(yù)，誘導(dǎo)SIRT1表達(dá)后，E-選擇素水平下降，以上炎癥因子表達(dá)均有明顯的減少，說明槲皮素有減輕心肌I/R時血管內(nèi)皮損傷，抑制炎癥反應(yīng)的作用。

Figure 6.The SIRT1 expression in the myocardium was detected by Western blot.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs I/R group；△P＜0.05 vs Que+I/R group.圖6 Western blot檢測各組心肌SIRT1的表達(dá)

Figure 7.The expressions of ZO-1 and MLCP in the H5V cells were detected by Western blot.Mean±SD.n=10.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs H/R group；△P＜0.05 vs Que+H/R group.圖7 Western blot檢測H5V細(xì)胞ZO-1和MLCP蛋白的表達(dá)

EX527是公認(rèn)的SIRT1的抑制劑，為了驗證槲皮素抑制炎癥因子釋放的作用是否與SIRT1有關(guān)，本研究用EX527抑制了SIRT1的表達(dá)，當(dāng)EX527使SIRT1表達(dá)被抑制后，槲皮素降低上述因子含量的作用顯著減弱。以上結(jié)果說明槲皮素抑制I/R損傷時的炎癥反應(yīng)減輕微血管損傷，抑制炎癥細(xì)胞在微血管內(nèi)聚集的現(xiàn)象與SIRT1的上調(diào)部分相關(guān)，但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

ZO-1是第一個被發(fā)現(xiàn)的緊密連接相關(guān)的胞質(zhì)蛋白，主要表達(dá)在形成緊密連接的內(nèi)皮和上皮細(xì)胞內(nèi)，并將跨膜縫隙連接蛋白結(jié)合于肌動蛋白細(xì)胞骨架上，所以ZO-1的減少會導(dǎo)致屏障通透性的增高［11-12］。MLCP會使肌球蛋白輕鏈去磷酸化，從而抑制肌動蛋白（actin）與肌球蛋白（myosin）之間的橫橋移動［13］。而actin-myosin的收縮力可拉動鄰近細(xì)胞彼此分離（回縮），導(dǎo)致細(xì)胞間縫隙的形成，增加屏障的通透性［14］。

Figure 8.The tight junction protein ZO-1 in the endothelial cells was detectecd by immunofluorescence staining.The scale bar=20 μm.圖8 免疫熒光檢測內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)

Figure 9.F-actin arrangement was revealed by phalloidin staining.The scale bar=50 μm.圖9 鬼筆環(huán)肽染色檢測細(xì)胞微絲骨架形態(tài)

為了進(jìn)一步探討槲皮素降低血管通透性的作用機(jī)制，本實驗用Western blot法檢測了槲皮素對H/R內(nèi)皮細(xì)胞ZO-1與MLCP表達(dá)的影響，同時以免疫熒光的方法觀察了ZO-1在細(xì)胞的表達(dá)情況以及細(xì)胞骨架的排列。結(jié)果顯示H/R后，ZO-1與MLCP表達(dá)顯著降低，槲皮素干預(yù)后ZO-1與MLCP表達(dá)量均明顯回升，而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，沒有出現(xiàn)ZO-1與MLCP表達(dá)量回升的現(xiàn)象。鬼筆環(huán)肽是從毒蕈類鬼筆鵝膏中得到的有毒環(huán)狀七肽，用熒光物質(zhì)標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽可特異的與真核細(xì)胞的F-actin結(jié)合，從而顯示微絲骨架在細(xì)胞中的分布。細(xì)胞骨架染色結(jié)果顯示，H/R誘導(dǎo)損傷后，H5V細(xì)胞的actin排列紊亂，極性消失，細(xì)胞間縫隙增大。槲皮素干預(yù)后，actin恢復(fù)規(guī)則排列，而用EX527抑制SIRT1的表達(dá)后，其排列與H/R組比較，無顯著改善。以上結(jié)果提示槲皮素通過修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞間的縫隙連接降低H/R內(nèi)皮細(xì)胞屏障的通透性，該作用可能與SIRT1有關(guān)。但是本實驗尚未探索SIRT1是通過何種分子機(jī)制調(diào)節(jié)ZO-1與MLCP功能的，這將在今后的研究中逐漸揭示。