動脈粥樣硬化小鼠肝臟脂質代謝相關的PPAR-γ/LXR-α/ABCG1通路及炎癥因子的變化和化瘀祛痰方在其中的作用*

冷 雪，吳 瑤，王 瑩，呂美君，宋 囡，賈連群△

（遼寧中醫(yī)藥大學 1研究生學院，2重大科研平臺中醫(yī)臟象理論及應用教育部重點實驗室，3心腦合病中西醫(yī)結合防治技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，遼寧沈陽110847）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是常見的高發(fā)性人類心血管疾病，也是致死率極高的疾病之一，發(fā)病機制學說中多以脂質浸潤學說和炎癥學說為主［1］。而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)脂質代謝紊亂形成泡沫細胞與膽固醇調控有密切聯(lián)系，這也是啟動AS發(fā)生的關鍵步驟之一，同時長期的高脂飲食造成的肝臟炎癥反應也是引發(fā)AS發(fā)生的關鍵［2-3］。過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatoractivated receptors，PPARs）是調節(jié)脂質代謝的重要轉錄調節(jié)因子，PPAR-γ是PPARs家族成員之一，作為一種重要的核受體轉錄因子，可與配體結合并激活啟動下游一系列參與脂質代謝的基因表達，包括可以通過肝X受體（liver X receptors，LXRs）參與調控下游ATP結合盒轉運體A1/G1（ATP-binding cassette transporter A1/G1，ABCA1/ABCG1）［4］，從而起到介導膽固醇流出的作用，此外PPAR-γ還參與對炎癥反應的調控［5］。Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）是Toll樣受體家族的重要成員之一，作為關鍵的免疫反應信號轉導受體可參與對炎癥反應的調控作用，從而影響AS的發(fā)生發(fā)展等多個環(huán)節(jié)［6］。

中醫(yī)病機認為AS多為脾失健運，痰瘀互結引起，治療多以健脾益氣、化瘀祛痰為主。本課題組一直致力于對遼寧中醫(yī)藥大學楊關林教授研制的、專利號為ZL200710010845.9的化瘀祛痰方（Huayu-Qutan recipe，HYQT）的研究，前期發(fā)現(xiàn)其可以參與對AS小鼠肝臟膽固醇代謝相關基因的調控［7-8］，而其具體通過何種機制介導肝臟膽固醇外流及對脂質代謝紊亂引起的肝臟慢性炎癥的影響機制尚未完全闡釋。因此，本研究應用ApoE-/-小鼠構建AS模型，以PPAR-γ介導的脂質代謝通路和炎癥反應的關鍵點TLR4為切入點，探討化瘀祛痰方對動脈硬化小鼠肝臟脂質代謝及炎癥反應的影響及作用機制，為中藥防治AS的臨床應用提供一定的依據。

材料和方法

1 主要藥物試劑及儀器

化瘀祛痰方為遼寧中醫(yī)藥大學楊關林教授依據中西醫(yī)理論及臨床對AS的研究經驗組方而成，并獲得國家發(fā)明專利（ZL200710010845.9）。本方由黨參30 g、黃芪30 g、絞股藍30 g、丹參15 g、茯苓15 g、法半夏15 g、石菖蒲20 g、川芎20 g、赤芍15 g和郁金15 g組成［9-10］。以上藥材均購于遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，均由本院中藥師鑒定符合2015年版《中國藥典》的標準。藥物由遼寧中醫(yī)藥大學動物實驗中心統(tǒng)一煎煮，通過浸泡、煎煮等工序，制成水煎劑，最終生藥量為1.79 kg/L?？筆PAR-γ抗體、抗LXR-α抗體和抗ABCG1抗體購自博奧森公司（批號分別為bs-0530R、bs-10311R和bs-23382R）；游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）、甘油三酯（triglyceride，TG）、TLR4、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒購自酶聯(lián)公司（批號：ml002083、ml063270、ml037978、ml002095和ml001814）；油紅O染色購自索萊寶公司（G1260）；HE染色液和Bradford蛋白質測定試劑盒購自碧云天公司（c0105和p0006）；血脂生化檢測試劑盒購自上海透景診斷科技有限公司（BH016Z、BH017Z、BH018Z和BH019Z）。全自動生化分析儀購自東芝公司；多功能蛋白印跡成像和定量分析系統(tǒng)購自ProteinSimple。

2 動物

SPF級雄性ApoE-/-小鼠24只（體重18～20 g），雄性C57BL/6J小鼠8只，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2012-0001。由遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物中心進行飼養(yǎng)，自由飲水、攝食，動物實驗符合遼寧中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會標準，實驗動物倫理審查編號為21000092017068。

3 主要方法

3.1 分組、造模及給藥 小鼠適應性喂養(yǎng)1周后，24只ApoE-/-小鼠隨機分為模型（model）組、辛伐他?。╯imvastatin）組和化瘀祛痰方（HYQT）組，8只C57BL/6J小鼠作為正常對照（control）組。除正常對照組每日給予基礎飼料外，其它幾組（模型組、辛伐他汀組和化瘀祛痰方組）每日給予高脂飼料（含21%脂肪、10%豬油、1%膽固醇等），自由攝食，飲水不限。飼喂12周后，辛伐他汀組和化瘀祛痰方組除給予高脂飼料外，開始灌胃給藥，每天灌胃1次。藥物劑量按人和動物體表比值換算，辛伐他汀組給予2.275 mg·kg-1·d-1，化瘀祛痰方組給予含生藥 20 g·kg-1·d-1［9］。正常對照組與模型組每日給予等體積的生理鹽水。給藥8周后，檢測血脂，并取材。

3.2 各組小鼠血脂的檢測 小鼠檢測前12 h禁食不禁水，取材麻醉（10%水合氯醛），眼球采血，靜置30 min后，3 500 r/min離心25 min，取血清分裝，保存于-20℃待用。全自動生物化學分析儀檢測血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量。

3.3 各組小鼠肝臟HE染色的觀察 取小鼠肝臟組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，切片（5 μm），根據蘇木精伊紅染色試劑盒步驟進行操作，最后經中性樹膠封片，光學顯微鏡下拍照觀察。

3.4 各組小鼠肝臟油紅O染色 小鼠肝臟冰凍切片6 μm，經4%多聚甲醛固定，60%異丙醇浸洗，油紅O染色15 min等常規(guī)油紅O染色步驟后封片拍照。

3.5 各組小鼠血清及肝組織FFA、TG、TLR4、TNF-α和IL-1β的ELISA檢測 具體操作嚴格按照ELISA試劑盒說明書步驟進行。

3.6 各組小鼠肝組織PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表達的測定 取各組小鼠肝臟0.1 g，加入1 000 μL蛋白裂解液提取，之后進行蛋白濃度測定。常規(guī)電泳轉膜后封閉1 h（5%脫脂奶粉），分別加入I抗［兔抗小鼠 PPAR-γ（1∶1 000）、LXR-α（1∶1 000）和ABCG1（1∶1 000）］4℃封閉過夜，次日TBST洗滌 4次，每次10 min，之后II抗孵育（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST洗滌4次，每次10 min。制發(fā)光液，全自動凝膠成像分析，以β-actin作為內參照進行灰度值統(tǒng)計。

4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 各組小鼠血脂水平變化比較

與control組相比，model組小鼠血清TG、TC和LDL-C水平顯著升高（P＜0.01），HDL-C水平顯著降低（P＜0.01）；與model組相比，simvastatin組和HYQT組 TG、TC和LDL-C水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），HDL-C水平顯著升高（P＜0.01）；simvastatin組與HYQT組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見表1。

表1 各組小鼠血脂水平變化比較Table 1.Comparison of the serum lipid levels in the mice of each group（mmol/L.Mean ±SD.n=8）

2 各組小鼠肝臟的病理觀察

HE染色可見，control組肝臟細胞排列致密均勻，結構正常；與control組比較，model組的肝臟細胞體積明顯增大，肝竇變??；simvastatin組和HYQT組的病變程度較model組明顯減輕，肝細胞膨大程度減弱，脂肪空泡較少，肝竇變化有所恢復，見圖1。

Figure 1.Morphological characteristics of the liver tissues in all groups（HE staining，×200）.圖1 各組小鼠肝臟的病理變化觀察

3 各組小鼠肝臟脂質沉積情況及肝臟內FFA和TG含量的比較

油紅O染色可見，control組肝臟無明顯脂質沉積情況；與control組比較，model組小鼠肝臟脂質沉積顯著，肝臟內可見明顯的脂滴，同時肝臟內FFA和TG含量顯著升高（P＜0.01）；simvastatin組和HYQT組小鼠肝臟的脂質沉積情況有明顯改善，脂滴不同程度減輕，肝臟內FFA和TG含量顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），見圖2及表2。

Figure 2.Lipid deposition of the liver tissues in all groups（oil red O staining，×200）圖2 各組小鼠肝臟脂質沉積情況的比較

4 各組小鼠血清及肝臟炎癥相關因子TLR4、TNF-α和IL-1β含量的變化

與control組比較，model組小鼠血清及肝臟內TLR4、TNF-α和IL-1β含量顯著升高（P＜0.01）；與model組比較，simvastatin組和HYQT組的TLR4、TNF-α和IL-1β含量均不同程度增高（P＜0.01）；simvastatin組和HYQT組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見表3、4。

5 各組小鼠肝臟PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表達的變化

與 control比較，model組小鼠肝臟內 PPAR-γ、LXR-α和ABCG1的蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；與 model組比較，simvastatin組肝臟內PPAR-γ和ABCG1的蛋白表達水平顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），LXR-α的蛋白表達水平有所增加，但差異無統(tǒng)計學顯著性；HYQT組肝臟內的PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白顯著降低（P＜0.01）；simvastatin組與HYQT組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

表3 各組小鼠血清TLR4、TNF-α和IL-1β含量的比較Table 3.Serum levels of TLR4，TNF-α and IL-1β of the mice in all groups（Mean±SD.n=8）

表4 各組小鼠肝臟組織內TLR4、TNF-α和IL-1β含量的變化Table 4.Liver levels of TLR4，TNF-α and IL-1β of the mice in all groups（Mean±SD.n=8）

Figure 3.The protein levels of PPAR-γ，LXR-α and ABCG1 in mouse liver tissues of each group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group.圖3 各組小鼠肝臟PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表達水平的比較

討 論

目前中醫(yī)中沒有明確的動脈粥樣硬化概念，但是有關于“眩暈”、“中風”、“胸痹”之說［11］。西醫(yī)的脂質浸潤學說提到高血脂引起的脂代謝異常是AS啟動的關鍵因素之一，高血脂概念在中醫(yī)中多用“痰濕”進行描述，痰濕的產生，其發(fā)病關鍵在脾，中醫(yī)認為脾為生痰之源，其與肝密不可分［12］。因“木之性主于疏泄，食氣入胃，全賴肝木之氣以疏泄之，而水谷乃化”（《血證論·臟腑病機論》）。五行中脾為土，肝為木，土雍侮木，脾病及肝。肝主導疏泄功能，能促進脾胃的運化，體內的膏脂運輸代謝都需要肝的作用?！端貑枴毭握摗吩唬骸巴恋媚径_”，若肝的功能正常，疏泄順暢，不僅促使脾胃功能的正常發(fā)揮，脾胃運化有序，還可保障膽汁正常代謝，使精微得以上輸，濁陰得以下降，脂質代謝輸布正常，以此來避免相關高脂血癥和AS的發(fā)生。此外AS是公認的慢性炎癥性疾病，有研究發(fā)現(xiàn)脂質代謝與炎癥反應有密切的關聯(lián)，降脂治療可以有效的緩解炎癥反應［13］。這說明脂質代謝紊亂和炎癥反應對AS的發(fā)展至關重要。以上可見肝臟內脂質代謝和炎癥反應的調控是治療AS的關鍵因素。

針對動脈硬化脾虛肝郁、痰濕血瘀的病機理念，楊關林教授研制的化瘀祛痰方藥具有健脾疏肝“化痰泄?jié)帷钡墓π?，在臨床上也取得了不錯的療效。目前課題組通過對化瘀祛痰方的研究發(fā)現(xiàn)其可以改善AS家兔［14］和高脂血癥大鼠［15-17］等肝臟的脂質沉積及肝損傷情況，以及可以減輕油酸和棕櫚酸誘導的HepG2細胞脂質沉積情況［18］，在對AS小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，化瘀祛痰方藥參與抑制AS的形成與肝臟膽固醇攝取和轉化相關基因表達有關［8］。本研究結果顯示，模型組小鼠血清中TG、TC和LDL-C含量明顯升高，HDL-C明顯下降，HE和油紅O染色顯示肝臟存在大量的脂質沉積和脂肪細胞變性，同時肝臟內FFA和TG顯著升高。與模型組比較，化瘀祛痰方組小鼠血清中TG、TC和LDL-C含量顯著降低，HDL-C明顯升高，肝臟脂質沉積程度減輕，肝臟內FFA和TG顯著降低。這些結果提示化瘀祛痰方在一定程度上可以起到降血脂、改善肝臟脂質沉積的情況。

過氧化物酶活化受體參與糖脂代謝、炎癥反應等一系列生理過程，PPAR-γ是其家族成員之一。PPAR-γ作為一種核受體轉錄因子通過配體的調控可以激活下游的相關糖脂代謝的一系列基因和蛋白的表達，同時可以參與對某些炎癥因子的調控，從而影響 AS 疾病的發(fā)展［19］。ABCA1/ABCG1是PPAR-γ轉錄調控的下游靶基因。有研究顯示，PPAR-γ可以通過調控下游的ABCA1基因來調控巨噬細胞中膽固醇的流出，從而抑制泡沫細胞的形成，然而相關報道顯示PPAR-γ并不直接作用于ABCA1/ABCG1，可能是通過與LXR-α作用而間接發(fā)揮調控ABCA1/ABCG1的作用［20］。

LXR是一種氧化固醇激活核受體，是膽固醇代謝重要的感受器［21］，可以與PPAR-γ通路進行偶聯(lián)，從而參與脂質代謝的調控，發(fā)揮抗AS的作用［22］。ABCG1同ABCA1一樣可以參與調控細胞內膽固醇的流出，在脂質代謝中發(fā)揮重要的作用。研究者在體外實驗中已證實增加巨噬細胞中ABCG1的表達可促進細胞膽固醇逆轉運（reverse cholesterol transport，RCT）過程［23］，此外LXR可以參與調節(jié)ABCG1［24］，同時PPAR-γ/LXR-α/ABCA1（ABCG1）通路是參與脂質代謝的經典通路之一［25］。本實驗通過Western blot法檢測了PPAR-γ/LXR-α/ABCG1通路相關蛋白的表達，以評價小鼠肝臟脂代謝紊亂的情況，同時探討化瘀祛痰方在其中的作用。實驗結果顯示模型組小鼠肝臟內PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表達明顯降低，化瘀祛痰方組小鼠肝臟內PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表達升高，提示化瘀祛痰方可通過此通路達到抑制小鼠肝臟脂質代謝紊亂的作用。

TLR4是Toll樣受體超家族成員之一，是參與免疫和炎癥反應的重要膜受體［26］，亦參與AS的病理生理過程［27］。研究顯示TLR4可以與PPAR-γ發(fā)生偶聯(lián)，在巨噬細胞中，PPAR-γ是TLR4/NF-κB信號通路中一個關鍵的負調控因子［28］。此外，TNF-α和IL-1β是參與細胞炎癥反應的經典因子，IL-1β是炎癥反應的重要介質，研究顯示人參皂苷Rb1可能通過降低肝細胞IL-1β等炎癥因子的表達而改善高脂血癥大鼠肝臟的脂質沉積［29］，紫薯花色苷提取物可以通過降低IL-1β等炎癥因子來抑制AS的發(fā)展［30］；有研究也顯示TNF-α可以通過介導LXR-α來參與對HepG2細胞內膽固醇外流的作用，參與脂質代謝過程［31］；此外TNF-α與IL1β也受到TLR4介導的炎癥信號通路的影響，TLR4可以通過激活NF-κB引起下游如TNF-α、IL1β等促炎細胞因子的轉錄和表達，造成肝細胞的炎癥損傷，因此抑制TLR4和下游TNF-α和IL-1β等炎癥因子的表達對AS防治有重要的意義［6］。本研究通過ELISA檢測結果表明，模型組小鼠血清及肝臟內TLR4、TNF-α和IL-1β的含量明顯增加，給予祛痰化瘀方后，小鼠血清及肝臟內TLR4、TNF-α和IL-1β的含量明顯下降，提示脂代謝紊亂可以促進炎癥反應的發(fā)生，同時化瘀祛痰方具有一定程度抑制肝臟炎癥反應的作用。

綜上所述，化瘀祛痰方可以通過調控肝臟PPAR-γ/LXR-α/ABCG1通路及減弱肝臟TLR4介導的炎癥反應起到對AS小鼠肝臟的保護作用，這也可能是其防治AS等相關疾病的機制之一。本研究可能為臨床防治AS相關疾病提供新的思路。