小鼠黑色素瘤細(xì)胞外泌體促進(jìn)成纖維細(xì)胞表達(dá)Rac1蛋白*

把小云，王祎婷，常秀林，段乳俠，方廖瓊，△

（1超聲醫(yī)學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶醫(yī)科大學(xué)生物工程學(xué)院，重慶400016；2西南大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，重慶400716）

腫瘤并非孤立的實(shí)體，其生存發(fā)展涉及到復(fù)雜微環(huán)境，正如一個(gè)多世紀(jì)之前的“種子和土壤”假說［1］，腫瘤細(xì)胞（種子）離不開微環(huán)境（土壤）的支持，腫瘤微環(huán)境是由基質(zhì)細(xì)胞、分泌因子、細(xì)胞外基質(zhì)組分、外泌體等構(gòu)成的復(fù)雜體系［2-3］，其中外泌體是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞間通訊的特殊媒介，可攜帶親本細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸等信息物質(zhì)傳遞給靶細(xì)胞，賦予靶細(xì)胞“新的”生物學(xué)功能［3］。研究表明，實(shí)體組織中較為豐富的成纖維細(xì)胞可以在腫瘤外泌體的介導(dǎo)下由正常成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts，CAF）而觸發(fā)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，分泌多種生長(zhǎng)因子和趨化因子，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程［4］，但具體的機(jī)制還未明確。值得一提的是，Ras相關(guān)C3肉毒毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）蛋白可以參與CAF介導(dǎo)的腫瘤微環(huán)境重塑以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。Rozenchan等［5］研究表明CAF內(nèi)Rac1蛋白表達(dá)水平顯著高于正常成纖維細(xì)胞，且Rac1的表達(dá)水平與乳腺癌細(xì)胞入侵淋巴結(jié)的活躍性正相關(guān)。本課題組前期的研究表明小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體可誘導(dǎo)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）侵襲能力的表達(dá)［6］，這提示我們B16-F10細(xì)胞外泌體是影響MEF侵襲性表征改變的重要介質(zhì)，但具體的分子機(jī)制還有待深入研究。本研究是在此基礎(chǔ)上通過建立B16-F10細(xì)胞外泌體與MEF共培養(yǎng)體系，檢測(cè)共培養(yǎng)后MEF中Rac1蛋白表達(dá)水平變化，初步探索了B16-F10細(xì)胞外泌體影響MEF中Rac1蛋白表達(dá)的情況，為后期深入研究B16-F10細(xì)胞外泌體影響MEF侵襲的機(jī)制提供參考資料。

材料和方法

1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠（孕13.5 d）由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

2 細(xì)胞和主要試劑

小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM和RPMI-1640培養(yǎng)液購(gòu)自Hy-Clone；胎牛血清購(gòu)自ExCell Bio；腫瘤易感基因101（tumor susceptibility gene 101，Tsg101）和酪氨酸酶相關(guān)蛋白2（tyrosinase-related protein 2，Tyrp2）抗體購(gòu)自Abcam；Rac1抗體購(gòu)自Affinity；DAPI染色液購(gòu)自碧云天；PKH26染色試劑購(gòu)自Sigma；兔二步法檢測(cè)試劑盒（兔增強(qiáng)聚合物法檢測(cè)系統(tǒng)）PV9001和DAB顯色試劑盒（ZLI-9018）購(gòu)自中杉金橋公司。

3 主要方法

3.1 B16-F10細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體制備 使用含10%胎牛血清、1%雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)B16-F10細(xì)胞，并在37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。參考Théry等［7］制備外泌體的方法：預(yù)先將胎牛血清100 000×g超高速離心8 h去除胎牛血清中的外泌體，用含10%去除外泌體的胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640完全培養(yǎng)液培養(yǎng)B16-F10細(xì)胞，待細(xì)胞在75 cm2的細(xì)胞瓶中匯合度達(dá)到80%左右，棄上清液，PBS清洗2次，換成去除外泌體的胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液300×g（4℃）離心 10 min，棄沉淀。上清液 2 000×g（4℃）離心15 min，棄沉淀。上清液5 000×g（4℃）離心15 min，棄沉淀。上清液100 000×g（4℃）離心70 min，收集沉淀，加入PBS緩沖液，100 000×g（4℃）離心70 min，收集沉淀，所得即為外泌體。

3.2 MEF的原代提取及培養(yǎng) 選擇孕期在12～14 d的C57BL/6小鼠頸椎脫臼致死，在無(wú)菌條件下取出胚胎，去除胚胎頭部，尾部，四肢及內(nèi)臟部分。用剪刀將剩余部分剪碎，反復(fù)研磨后，置于37℃，用0.25%胰蛋白酶處理5 min，胎牛血清終止消化，120目過濾篩篩除去顆粒性組織塊，將過濾后懸液96×g離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀用含有10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)液重懸，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。

3.3 納米顆粒跟蹤分析（nonoparticle tracking analysis，NTA）檢測(cè)粒徑分布 將離心后的外泌體沉淀溶于1 mL的PBS中，渦旋使其盡可能均勻分布，將其稀釋至1×1012/L的外泌體懸液，取1 mL外泌體懸液置于干凈的比色皿內(nèi)，使用Malvern Panalytical粒度儀檢測(cè)B16-F10細(xì)胞外泌體粒徑分布情況。

3.4 透射電鏡負(fù)染色觀察外泌體形態(tài)特征 將離心后的外泌體沉淀溶于1 mL的PBS中，渦旋使其盡可能均勻分布，將其稀釋至1×1012/L的外泌體懸液，用100 μL微量注射器吸取外泌體懸液，取10 μL滴在銅網(wǎng)上，過夜晾干，晾干后的銅網(wǎng)上滴加10 μL醋酸雙氧鈾溶液，吸去多余液體，染色2 min，雙蒸水潤(rùn)洗，晾干后用透射電鏡觀察。

3.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)外泌體特征蛋白Tsg101和Tyrp2及MEF中Rac1蛋白表達(dá)水平 準(zhǔn)備適量外泌體及MEF樣本，用含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液冰上裂解10 min后，收集上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取10 μg總蛋白量的蛋白提取液加入loading buffer，煮沸90 s使蛋白變性，進(jìn)行SDS-PAGE，110 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，5%BSA封閉后加入I抗（Tsg101、Tyrp2和Rac1抗體）4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的II抗室溫孵育2 h，清洗后ECL法顯色，采用ImageJ軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

3.6 激光共聚焦顯微鏡觀察MEF攝取外泌體過程 避光條件下，使用稀釋后的PKH26染色液對(duì)外泌體的磷脂雙分子膜進(jìn)行染色5 min，加入適量胎牛血清終止染色后添加PBS重懸外泌體沉淀，100 000×g（4℃）離心70 min，除去多余染色液。收集離心后的外泌體沉淀，在共聚焦皿中將外泌體和MEF共培養(yǎng)0、12、24和36 h。待共培養(yǎng)結(jié)束，棄細(xì)胞培養(yǎng)上清液，PBS清洗，加入4%多聚甲醛避光固定；避光條件下進(jìn)行DAPI染細(xì)胞核；棄去DAPI染色液，加入抗熒光淬滅液，共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

3.7 免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Rac1蛋白表達(dá)預(yù)先將細(xì)胞接種至鋪有爬片的6孔板內(nèi)，置于孵箱內(nèi)使其貼壁后進(jìn)行MEF與B16-F10細(xì)胞外泌體共培養(yǎng)0、12、24和36 h。待共培養(yǎng)結(jié)束，PBS清洗MEF后固定30 min，0.5%Triton X-100通透細(xì)胞，加入內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑進(jìn)行封閉處理，37℃孵育I抗，經(jīng)反應(yīng)增強(qiáng)液孵育后，室溫孵育II抗，DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗、脫水、透明、封片，在顯微鏡下觀察，ImageJ軟件分析每張爬片的陽(yáng)性表達(dá)水平并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，GraphPad Prism 7.0軟件作圖。每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 B16-F10細(xì)胞外泌體結(jié)構(gòu)特征

超速離心法制備的B16-F10細(xì)胞外泌體通過透射電鏡負(fù)染色觀察可見，外泌體呈典型茶托狀形態(tài)特征，見圖1A；Malvern Panalytical粒度儀檢測(cè)結(jié)果表明，B16-F10細(xì)胞外泌體的粒徑分布范圍在141～255 nm處，見圖1B；Western blot檢測(cè)到B16-F10細(xì)胞外泌體表達(dá)Tsg101和Tyrp2蛋白，見圖1C。

Figure 1.Identification of B16-F10 cell-derived exosomes.A：exosomes were confirmed by negative-staining transmission electron microscopy（scale bar=100 nm）；B：exosome particle size distribution was quantified by Malvern Panalytical particle size analyzer；C：Western blot for determing the protein expression of tumor susceptibility gene 101（Tsg101）and tyrosinaserelated protein 2（Tyrp2）in the exosomes.圖1 B16-F10細(xì)胞外泌體的鑒定

2 MEF攝取B16-F10細(xì)胞外泌體

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)12 h的MEF胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)了少量PKH26標(biāo)記的B16-F10細(xì)胞外泌體，共培養(yǎng)24和36 h的MEF胞質(zhì)及核周圍聚集了大量PKH26標(biāo)記的B16-F10細(xì)胞外泌體，見圖2。這表明隨著時(shí)間增加，MEF攝取B16-F10細(xì)胞外泌體的能力有所增強(qiáng)。

Figure 2.Uptake of B16-F10 cell-derived exosomes by MEF was observed under laser confocal microscope（scale bar=50 μm）.The nuclei were labeled by DAPI，while the exosomes were labeled by PKH26.A：co-culture at 0 h；B：co-culture at 12 h；C：co-culture at 24 h；D：co-culture at 36 h.圖2 MEF攝取B16-F10細(xì)胞外泌體

3 B16-F10細(xì)胞外泌體促進(jìn)MEF表達(dá)Rac1蛋白

免疫細(xì)胞化學(xué)染色實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果中Rac1陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色；與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)12、24和36 h的MEF內(nèi)Rac1陽(yáng)性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)（P＜0.05或P＜0.01），見圖3A。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與共培養(yǎng)0 h相比較，共培養(yǎng)24和36 h的MEF中Rac1蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.01），見圖3B。這些結(jié)果均證明黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體能夠促進(jìn)MEF中Rac1蛋白表達(dá)。

討 論

Figure 3.B16-F10 cell exosomes promoted the expression of Rac1 protein in MEF.A：immunocytochemical staining（scale bar=50 μm）；B：Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h group.圖3 B16-F10細(xì)胞外泌體促進(jìn)MEF表達(dá)Rac1蛋白

黑色素瘤源于表皮黑素細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，是最具侵襲性的皮膚癌之一，預(yù)后極差，一旦侵襲轉(zhuǎn)移，5年內(nèi)的存活率為5%［8］。近年來，隨著研究的深入，研究人員證明黑色素瘤細(xì)胞外泌體攜帶豐富的蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等細(xì)胞來源的信息分子，可直接充當(dāng)細(xì)胞間通訊的媒介，改造周圍基質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤微環(huán)境的組成部分，促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［9］。有研究表明，具有高度轉(zhuǎn)移性的B16-F10細(xì)胞外泌體通過致癌蛋白MET（受體酪氨酸激酶）可導(dǎo)致骨髓祖細(xì)胞具有腫瘤惡性表型特征，促進(jìn)了原發(fā)性腫瘤的轉(zhuǎn)移行為［10］，這表明高度轉(zhuǎn)移性的B16-F10細(xì)胞外泌體可以改造正常細(xì)胞的生物學(xué)功能。本課題組前期致力于研究黑色素瘤細(xì)胞外泌體是如何營(yíng)造有利于黑色素瘤細(xì)胞生存發(fā)展的微環(huán)境，基于成纖維細(xì)胞是大多數(shù)實(shí)體組織中最豐富的基質(zhì)細(xì)胞，具有在一定條件下轉(zhuǎn)變?yōu)镃AF的潛力，成為腫瘤微環(huán)境的重要組分，我們證明了小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體能夠影響正常胚胎成纖維MEF侵襲性改變［6］，但有關(guān)B16-F10細(xì)胞外泌體如何影響MEF侵襲性的具體機(jī)制還未探索，有待深入探究。

Rac1蛋白可以調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重組，形成侵襲偽足，降解細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［11-12］。近年來大量的研究表明在結(jié)腸癌［13］、乳腺癌［14］、黑色素瘤［12］等多種惡性腫瘤細(xì)胞中 Rac1蛋白表達(dá)水平較高，且其表達(dá)水平與細(xì)胞的侵襲能力緊密相關(guān)。Lee等［15］的研究表明膽脂瘤上皮中Rac1的mRNA的表達(dá)水平相比于正常皮膚平均增加2.94倍，且Rac1的異常的表達(dá)促進(jìn)上皮細(xì)胞的侵襲性。Tian等［16］的研究表明在黑色素瘤B16細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)水平的Rac1蛋白會(huì)誘導(dǎo)F-肌動(dòng)蛋白聚合，觸發(fā)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，進(jìn)一步增強(qiáng)了細(xì)胞的侵襲性。Zhang等［17］通過生物學(xué)信息分析證明了黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體內(nèi)Rac1蛋白表達(dá)水平較高。因此，本研究通過建立B16-F10細(xì)胞與MEF共培養(yǎng)體系證明攝取了B16-F10細(xì)胞外泌體的MEF中Rac1蛋白表達(dá)水平有所升高，但究竟是B16-F10細(xì)胞外泌體釋放Rac1蛋白到MEF，還是外泌體內(nèi)的某種活性成分調(diào)節(jié)MEF內(nèi)Rac1蛋白表達(dá)升高，以及B16-F10細(xì)胞外泌體是通過Rac1的哪種信號(hào)通路調(diào)控MEF的侵襲過程等方面還需要更深入的研究。

綜上所述，本研究初步證明了黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體可促進(jìn)MEF表達(dá)Rac1蛋白。這為本課題組后期探索黑色素瘤細(xì)胞外泌體導(dǎo)致成纖維細(xì)胞侵襲性改變的機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。下一步我們將重點(diǎn)研究黑色素瘤B16-F10細(xì)胞外泌體是否通過Rac1相關(guān)信號(hào)途徑促進(jìn)MEF的侵襲能力。