焦亡介導(dǎo)高糖引起的小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1炎癥與損傷*

羅立慧 ，傅曉瑩 ，鄭揚希 ，梁偉杰 ，智喜梅 ，鄧海鷗，張偉杰，王瑞雪，吳 文△

（1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州510515；2廣東省人民醫(yī)院，廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，廣東省老年醫(yī)學(xué)研究所東病區(qū)內(nèi)分泌科，廣東廣州510080；3汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭515063）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）合并骨質(zhì)疏松癥（diabetic osteoporosis，DOP）是指長期血糖升高引起的骨骼基質(zhì)層破壞、骨密度降低、骨折風(fēng)險升高的一種骨病，其發(fā)病率高、治療措施有限，是DM嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，已成為當(dāng)前國際上有關(guān)糖尿病并發(fā)癥研究的熱點之一［1］。迄今，DOP骨代謝異常的作用機制尚未完全闡明，其中成骨細(xì)胞（osteoblast，OB）功能障礙處于骨代謝異常的核心環(huán)節(jié)［2-3］。因此，深入探討高血糖對OB的損傷作用及其機制具有重要的臨床意義。

近年來，DM被認(rèn)為是一種慢性免疫炎癥性疾病，特別是其并發(fā)癥與慢性炎癥有密切的關(guān)系［4］。細(xì)胞焦亡（pyroptosis），也被稱為“細(xì)胞炎性壞死”，是一種和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的程序性細(xì)胞死亡方式。細(xì)胞焦亡這一術(shù)語由Brennan和Cooksen在2000年提出［5］，并于2012年被國際細(xì)胞死亡命名委員會定義為胱天蛋白酶1（caspase-1，CASP1）依賴性程序性細(xì)胞死亡［6］。焦亡發(fā)生過程中所產(chǎn)生的炎癥小體（inflammasome）是由胞漿內(nèi)核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）等模式識別受體及胱天蛋白酶1前體（procaspase-1）經(jīng)含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）銜接而組裝形成的大分子復(fù)合物。炎癥小體能識別細(xì)菌、病毒等感染性或非感染性危險信號分子，將非活性的procaspase-1聚集；procaspase-1則自發(fā)解構(gòu)形成兩類亞基（p20和p10），2個p20亞基和2個p10亞基組裝成四聚體并激活CASP1，進(jìn)而促進(jìn)白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-18等炎癥細(xì)胞因子大量釋放，引起“瀑布效應(yīng)”［7］。細(xì)胞焦亡與DM及其并發(fā)癥關(guān)系密切，其中在DM相關(guān)心血管損害中的作用研究頗多。Qiu等［8］指出，高糖（high glucose，HG）激活NLRP3炎癥小體后能通過細(xì)胞焦亡途徑加重DM大鼠的心肌缺血/再灌注損傷，同時采用CASP1抑制劑可減輕心肌細(xì)胞損傷；Luo［9］等報道，在2型 DM大鼠在體或離體模型中均可見NLRP3、procaspase-1、CASP1和IL-1β表達(dá)的增加，但是，沉默NLRP3基因可抑制糖尿病心肌病的發(fā)展。此外，亦有研究表明，焦亡能夠介導(dǎo)DM引起的慢性腎小球疾病［10］及視網(wǎng)膜病變［11］。然而，細(xì)胞焦亡是否參與HG引起的骨代謝紊亂，至今鮮有報道。為此，本研究建立HG損傷MC3T3-E1細(xì)胞（小鼠胚胎成骨細(xì)胞）模型，旨在探討細(xì)胞焦亡是否參與HG引起的成骨細(xì)胞炎癥和損傷。

材料和方法

1 材料

針對CASP1基因的小干擾RNA（CASP1-siRNA）由廣州銳博生物公司設(shè)計合成；地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、羅丹明123（rhodamine 123，Rh123）及 2′，7′-二氯二氫熒光素二乙酯（2′，7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）購于 Sigma-Aldrich；抗NLRP3抗體和抗CASP1抗體購自Abcam公司；細(xì)胞計數(shù)試劑盒 8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）購于上海貝博生物科技有限公司；IL-18和IL-1β ELISA試劑盒由武漢華美生物工程有限公司提供；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；茜素紅染色試劑盒購自索萊寶科技有限公司；特級胎牛血清和α-MEM培養(yǎng)基購自Gibco BRL；MC3T3-E1細(xì)胞由上海中科院細(xì)胞庫提供。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) MC3T3-E1細(xì)胞為小鼠胚胎成骨細(xì)胞，來源于顱頂骨，培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基，置于 5%CO2、濕度 70%～80%、溫度37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培育。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)80%左右時，加入0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，根據(jù)消化情況迅速加入完全培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹落瓶壁細(xì)胞并吸出細(xì)胞懸液，在1 000 r/min條件下離心5 min，按1∶3～1∶5的比例進(jìn)行傳代及后續(xù)實驗。

2.2 實驗分組 實驗分為4組：（1）對照（control）組：α-MEM培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為5.5 mmol/L）處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h；（2）HG組：用高糖培養(yǎng)基（葡萄糖濃度為45 mmol/L）處理細(xì)胞24 h；（3）CASP1-siRNA+HG組：50 nmol/L CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后撤去，PBS沖洗后更換為高糖培養(yǎng)基繼續(xù)處理細(xì)胞24 h；（4）陰性對照（negative control，NC）siRNA+HG組：50 nmol/L NC siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后撤去，PBS沖洗后更換為高糖培養(yǎng)基處理細(xì)胞24 h。

2.3 CASP1-siRNA細(xì)胞轉(zhuǎn)染和最佳干擾序列的篩選 由廣州銳博生物公司設(shè)計并提供3條CASP1-siRNA序列（001：5′-GAAGGCCCATATAGAGAAA-3′；002：5′-CCAAGGTGATCATTATTCA-3′；003：5′-GCTGAAACATTTGTTGTCA-3′）和1條NC siRNA序列。用RNase-free water溶解siRNA凍干粉并配制成20 μmol/L的儲存液，在細(xì)胞密度達(dá)30%～50%實施轉(zhuǎn)染，按說明書要求稀釋siRNA及加入riboFECTTMCP Reagent制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物，使轉(zhuǎn)染濃度為50 nmol/L，室溫孵育10 min后進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，6 h后按實驗分組要求進(jìn)行相應(yīng)的干預(yù)措施。轉(zhuǎn)染效果評估通過Western blot法檢測CASP1的表達(dá)來進(jìn)行，選取沉默效果最佳的一個序列用于后續(xù)的實驗。實驗重復(fù)3次。

2.4 成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化 待細(xì)胞生長融合約80%時，根據(jù)實驗分組要求處理后更換成骨誘導(dǎo)分化液繼續(xù)培養(yǎng)，每3 d換液1次，其中誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基由含4%胎牛血清、10 nmol/L地塞米松、50 mg/L維生素C及10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MEM培養(yǎng)基配制而成。

2.5 CCK-8法測定細(xì)胞存活率 接種MC3T3-E1細(xì)胞于96孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，給予不同干預(yù)后，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書要求，先棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，于每孔加入 90 μL α-MEM和10 μL CCK-8試劑，37℃溫箱中孵育2～4 h，設(shè)定酶標(biāo)儀波長為450 nm，輕輕振動5 s，記錄各孔吸光度（A），并計算各組重復(fù)孔平均值，代入公式：細(xì)胞相對活力（%）=處理組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

2.6 Western blot法檢測NLRP3和CASP1蛋白表達(dá)水平 接種MC3T3-E1細(xì)胞于6孔板中，密度達(dá)80%后根據(jù)實驗分組予相應(yīng)處理后吸出培養(yǎng)基，預(yù)冷PBS沖洗 3次，每孔加入裂解液 30～40 μL，于冰上靜置裂解30 min，細(xì)胞刮刀充分刮取蛋白，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清并采用BCA法計算蛋白濃度。各組蛋白經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉60 min，隨后分別加入抗NLRP3抗體和抗CASP1抗體（均1∶1 000稀釋），4℃搖床孵育過夜，冷TBST漂洗3次，每次5 min，加入相應(yīng)的II抗（1∶2 500稀釋）4℃搖床孵育2 h，再予TBST漂洗3次，每次5 min，在PVDF膜上加入發(fā)光試劑ECL顯色，暗室曝光，最后凝膠成像系統(tǒng)掃描分析結(jié)果。實驗重復(fù)3次。

2.7 ELISA法檢測IL-18和IL-1β水平 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為待測標(biāo)本，按照ELISA試劑盒操作說明書步驟，往包被抗IL-18和IL-1β抗體的微孔板中分別加入待測標(biāo)本，最終每孔加入終止溶液終止反應(yīng)，5 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定吸光度（A），計算各組重復(fù)孔平均值，代入公式：IL-18和IL-1β的釋放率（%）=處理組A/對照組A×100%。實驗重復(fù)3次。

2.8 DCFH-DA染色熒光顯微鏡照相法檢測細(xì)胞內(nèi)ROS水平 將MC3T3-E1細(xì)胞傳代接種于24孔板，經(jīng)干預(yù)處理后，PBS液沖洗3次，每孔加入濃度為10 μmol/L的DCFH-DA熒光液200 μL，溫箱中孵育30 min，繼續(xù)PBS沖洗吸干，倒置熒光顯微鏡每個分組隨機拍攝3個高倍鏡視野，ImageJ 1.47i軟件記錄每張照片綠色熒光強度的平均值［即平均熒光強度（mean fluorescent intensity，MFI）］并進(jìn)行統(tǒng)計分析。實驗重復(fù)3次。

2.9 Rh123染色熒光顯微鏡測定成骨細(xì)胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP） 24孔板培育MC3T3-E1細(xì)胞，細(xì)胞融合約80%時干預(yù)細(xì)胞后予PBS潤洗3次，每孔加入含1 mg/L Rh123染色劑的無血清培養(yǎng)基200 μL，37℃培養(yǎng)箱中溫育45 min，隨后顯微鏡下隨機攝片，最后應(yīng)用圖像分析軟件計算MFI（反映MMP高低），并統(tǒng)計分析各組數(shù)據(jù)。實驗重復(fù)3次。

2.10 ALP活性測定 將MC3T3-E1細(xì)胞傳代接種于6孔板中，按照不同實驗分組予相應(yīng)干預(yù)后，更換成骨誘導(dǎo)分化液培養(yǎng)7 d，吸去培養(yǎng)基，每孔加入適量裂解液充分裂解60 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，上清液作為待測樣本，遵循ALP微板法測定試劑盒步驟添加試劑，在酶標(biāo)儀波長520 nm下測定各孔吸光度（A），根據(jù)說明書提供的公式計算出細(xì)胞ALP活性。

2.11 茜素紅鈣化結(jié)節(jié)染色 MC3T3-E1細(xì)胞接種于6孔板中，按實驗組要求給予相應(yīng)的干預(yù)后更換成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基，第21天時收集細(xì)胞，95%無水乙醇進(jìn)行樣本固定，茜素紅染色試劑染色，PBS沖洗，隨后在倒置顯微鏡下觀察鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩兩比較運用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HG上調(diào)成骨細(xì)胞NLRP3和CASP1蛋白的表達(dá)

HG作用于成骨細(xì)胞24 h，從6 h開始，與control組相比，NLRP3和CASP1蛋白表達(dá)水平分別升高，見圖1（P＜0.01），其中HG作用細(xì)胞24 h時，上述蛋白表達(dá)水平升高最明顯（P＜0.01）。

2 CASP1-siRNA最佳干擾序列的篩選

Western blot結(jié)果顯示，與control組比較，CASP1-siRNA 001和003均能顯著下調(diào)CASP1蛋白的表達(dá)（P＜0.01），其中003組CASP1的蛋白表達(dá)水平下調(diào)了76%，下降程度最為顯著，故選取CASP1-siRNA 003用于后續(xù)的實驗。CASP1-siRNA 002和NC siRNA對CASP1的蛋白表達(dá)無明顯影響，見圖2。

Figure 2.Screening of the most effective CASP1-siRNA in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group.圖2 CASP1-siRNA最佳干擾序列的篩選

3 沉默CASP1基因抑制HG對成骨細(xì)胞的毒性

為了觀察HG對MC3T3-E1成骨細(xì)胞活力的影響，我們分別進(jìn)行量-效及時-效關(guān)系的研究。首先以不同濃度（25、35、45和55 mmol/L）的葡萄糖對細(xì)胞作用24 h，觀察其對細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，與control組相比，上述濃度葡萄糖均有明顯的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞活力下降（P＜0.01），其中葡萄糖濃度為45和55 mmol/L時細(xì)胞毒性最明顯，細(xì)胞相對活力均下降均接近50%，且兩者之間無明顯差異，因此我們選定45 mmol/L作為葡萄糖損傷細(xì)胞的濃度，見3A；然后用45 mmol/L葡萄糖處理細(xì)胞不同時間（0、6、12和24 h），結(jié)果顯示，隨著葡萄糖干預(yù)時間的延長，細(xì)胞活力顯著降低，并且呈明顯的時間依賴關(guān)系（P＜0.01），24 h時的細(xì)胞相對活力下降到（57.03±1.36）%，見圖3B。根據(jù)上述結(jié)果，我們選定45 mmol/L葡萄糖干預(yù)MC3T3-E1細(xì)胞24 h來構(gòu)建HG損傷成骨細(xì)胞模型。

與control組相比，HG處理MC3T3-E1細(xì)胞24 h，可使細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.01）；與HG組比較，CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h能減輕HG的細(xì)胞毒性，使細(xì)胞活力顯著升高（P＜0.01）；NC siRNA對HG降低成骨細(xì)胞活力的作用無明顯影響，見圖3C。

Figure 3.Knockdown of CASP1 expression inhibited the cytotoxicity of high glucose（HG）on MC3T3-E1 osteoblasts.The cell viability was detected by CCK-8 assay.A：dose-dependent effect of HG；B：time-dependent effect of HG；C：the effect of CASP1-siRNA on the viability of the cells treated with HG.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖3 沉默CASP1基因抑制HG對成骨細(xì)胞的毒性

4 沉默CASP1基因減少HG引起的成骨細(xì)胞炎癥因子分泌

與control組相比，HG作用成骨細(xì)胞24 h能促進(jìn)IL-18及IL-1β的分泌（P＜0.01）；應(yīng)用CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后再予HG作用24 h，IL-18及IL-1β的分泌明顯減少，與HG組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA對HG促進(jìn)IL-18和IL-1β分泌的作用無明顯影響，見圖4。

Figure 4.Knockdown of CASP1 expression inhibited high glucose（HG）-induced secretion of IL-18（A）and IL-1β（B） in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖4 沉默CASP1基因減少HG引起的成骨細(xì)胞IL-18和IL-1β分泌

5 沉默CASP1基因抑制HG引起的成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

與control組比較，HG作用成骨細(xì)胞24 h可引起明顯的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致胞內(nèi)ROS堆積，MFI明顯升高（P＜0.01）；與HG組比較，以50 nmol/L CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后再用HG處理24 h，能顯著減少細(xì)胞內(nèi)ROS的堆積，MFI明顯降低（P＜0.01）；NC siRNA對HG促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)ROS生成的作用無明顯影響，見圖5。

Figure 5.Knockdown of CASP1 expression inhibited high glucose（HG）-induced accumulation of intracellular reactive oxygen species（ROS）in MC3T3-E1 osteoblasts（×40）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖5 沉默CASP1基因抑制HG引起的MC3T3-E1成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)

6 沉默CASP1基因抑制HG引起的MMP丟失

HG干預(yù)24 h可使成骨細(xì)胞內(nèi)Rh123的MFI值從（27.63±0.37）%（control組）降低至（10.33±0.88）%（P＜0.01）；CASP1-siRNA能夠減少成骨細(xì)胞MMP丟失，使MFI上升至（24.54±0.30）%，與HG組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA處理對HG引起的MMP丟失無明顯影響，見圖6。

7 沉默CASP1基因減輕HG對ALP活性的抑制

與control組比較，HG作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h可使ALP活性明顯下降（P＜0.01）；CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染可對抗HG對ALP活性的抑制作用（P＜0.01），使ALP活性升高，與HG組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA干預(yù)對HG抑制ALP活性的作用無明顯影響，見圖7。

Figure 6.Knockdown of CASP1 expression inhibited HG-induced loss of mitochondrial membrane potential（MMP） in MC3T3-E1 osteoblasts（×40）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖6 沉默CASP1基因抑制HG引起MC3T3-E1成骨細(xì)胞的MMP丟失

8 沉默CASP1基因可對抗HG引起的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少

成骨細(xì)胞培養(yǎng)至21 d時，經(jīng)茜素紅染色后鏡下可見橙紅色的礦化結(jié)節(jié)；HG作用細(xì)胞24 h可明顯減少礦化結(jié)節(jié)的形成，與control組比較有顯著差異（P＜0.01）；沉默CASP1表達(dá)可減弱HG對礦化結(jié)節(jié)形成的抑制作用，與HG組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；NC siRNA對HG減少礦化結(jié)節(jié)生成的作用無明顯影響，見圖8。

討 論

迄今已有實驗證實，自噬（autophagy）、凋亡（apoptosis）、壞死性凋亡（necroptosis）等多種細(xì)胞死亡方式參與DOP的發(fā)生和發(fā)展［12-14］。焦亡作為一種新近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞死亡方式，在DM導(dǎo)致多器官損傷如糖尿病心肌病、糖尿病腎病和糖尿病視網(wǎng)膜病變中起著重要作用［8-11］，但焦亡是否參與DOP的發(fā)生，目前尚未見報道。

Figure 7.Knockdown of CASP1 expression inhibited HG-induced reduction of ALP activity in MC3T3-E1 osteoblasts.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs HG group.圖7 沉默CASP1基因減輕HG對成骨細(xì)胞ALP活性的抑制

現(xiàn)已明確，OB功能障礙是骨代謝異常的核心環(huán)節(jié)［2-3］。高血糖可通過多種病理生理機制，例如氧化應(yīng)激與鈣超載［15］、炎癥及 PI3K/AKT 信號通路［12，16］等損傷OB或引起骨質(zhì)壞死［17-18］。本研究在HG損傷小鼠胚胎成骨細(xì)胞MC3T3-E1的實驗?zāi)Ｐ鸵沧C實，HG對OB損傷是多方面的，除了能引起明顯的細(xì)胞炎癥反應(yīng)外，還可使細(xì)胞存活率、ALP活性和礦化能力下降，ROS生成和MMP丟失增多等，這與郭寶磊［16］及Dong等［12］的報道相一致，表明這一細(xì)胞模型能較客觀地反映HG對MC3T3-E1成骨細(xì)胞的致炎癥與損傷作用，為深入研究HG對OB的損傷及其機制提供了可靠的細(xì)胞實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

Figure 8.Knockdown of casepase-1 expression reduces the HG-induced the mineralization capability in MC3T3-E1 osteoblasts（×200）.Mean±SEM.n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs the HG group.圖8 沉默CASP1基因可對抗HG引起的MC3T3-E1成骨細(xì)胞礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少

值得注意的是，在本研究中，我們觀察到：HG作用MC3T3-E1細(xì)胞可呈時間依賴性趨勢上調(diào)NLRP3和CASP1蛋白表達(dá)水平，且能促進(jìn)其下游炎癥因子如IL-18和IL-1β的釋放，這與Qiu等［8］與Luo等［9］在DM大鼠心肌細(xì)胞模型的研究結(jié)果相類似，并清晰地提示：在HG損傷OB過程中，可能存在細(xì)胞焦亡這一現(xiàn)象。于是，我們采用CASP1-siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)，進(jìn)一步觀察特異性沉默CASP1的表達(dá)對HG損傷OB的影響。實驗結(jié)果表明，沉默CASP1基因表達(dá)具有明顯的OB保護(hù)作用，能抑制HG對MC3T3-E1細(xì)胞的致炎癥及損傷作用，表現(xiàn)為細(xì)胞活力和ALP活性增高，礦化能力恢復(fù)，IL-18和IL-1β分泌、ROS生成及MMP丟失減少，這進(jìn)一步證實焦亡參與HG引起的OB炎癥和損傷。此外，Li等［17］發(fā)現(xiàn)，在DM大鼠模型中，抑制NLRP3炎性體分泌，可下調(diào)ASC、procaspase-1、IL-1β表達(dá)從而促進(jìn)牙槽骨損傷修復(fù)；Zhang等［18］亦指出，雙膦酸鹽通過NLRP3/caspase-1/IL-1β機制誘導(dǎo)DM小鼠發(fā)生下頜骨壞死。以上研究支持本文的實驗結(jié)果。

另外，由于血糖水平的高低與體內(nèi)胰島素缺乏和（或）胰島素抵抗水平密切相關(guān)，因此，在探討焦亡在高糖引起成骨細(xì)胞炎癥與損傷中的作用時，亦應(yīng)考慮胰島素水平在其中的作用。有研究指出，胰島素能刺激成骨細(xì)胞分化并導(dǎo)致骨鈣素（osteocalcin）生成增多，骨鈣素能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖，提高骨骼肌對胰島素的敏感性［19］。Gower等［20］報道，2型糖尿病的骨鈣素水平降低。鑒于胰島素對成骨細(xì)胞分化的作用，今后，本研究擬在2型糖尿病大鼠模型進(jìn)一步探討胰島素對焦亡損傷成骨細(xì)胞及炎癥反應(yīng)的影響。

綜上所述，本研究證實，焦亡介導(dǎo)HG誘導(dǎo)的小鼠胚胎成骨細(xì)胞炎癥和損傷，進(jìn)一步揭示DOP新的病理生理機制，并為防治DOP開拓了新思路。