舒洛地特通過抑制NOX4/NLRP3通路減輕高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管損傷*

李 婷，何學(xué)敏，彭榮東，李靜仁，付夏楠，周 麗，石國軍△，陳燕銘△

（1中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝性疾病科，廣東省糖尿病防治重點實驗室，廣東廣州510630；2中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床免疫中心，廣東廣州510630）

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）常見的微血管并發(fā)癥，是成年人最常見的致盲性眼病［1］，由于其缺乏特異性的治療方法，重點在于早期篩查早期防治，研究其發(fā)病機制及防治方法具有重大現(xiàn)實意義。內(nèi)皮細胞是視網(wǎng)膜微血管的重要組成部分，對維持視網(wǎng)膜微血管的結(jié)構(gòu)和功能完整性起重要作用。炎癥與DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，DR患者［2］的房水和血清中都發(fā)現(xiàn)了白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和IL-6等炎癥相關(guān)因子的增加。因此，抑制促炎癥分子，保護內(nèi)皮細胞，減輕DR的血管滲漏［3］，是目前研究的熱點。

IL-1β是核苷酸結(jié)合寡聚域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）炎癥小體（inflammasome）激活后產(chǎn)生的促炎介質(zhì)之一，敲除IL-1β受體基因緩解了小鼠DR的進展［4］。NLRP3炎癥小體是一個分子復(fù)合體，由3個部分組成：感受蛋白為NLRP3，銜接蛋白為含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC），效應(yīng)蛋白為前體胱天蛋白酶1（procaspase-1，Pro Casp-1）。NLRP3在DR中被激活［5］。抑制NLRP3炎癥小體可保護糖尿病誘導(dǎo)的內(nèi)皮細胞間緊密連接蛋白1（zonula occludens-1，ZO-1）和VE-鈣黏著蛋白（VE-cadherin，VE-Cad）［6］，這是減輕血管滲漏重要的一環(huán)。

活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）對內(nèi)皮細胞有損傷作用［7］。NADPH 氧化酶（NADPH oxidase，NOX）是脈管系統(tǒng)ROS主要的來源之一［8］。高糖刺激下，內(nèi)皮細胞中NOX4/ROS激活并誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體活化［9］；ROS還可通過降解細胞間黏附蛋白損傷內(nèi)皮細胞［10］。另外，研究表明DR患者中ROS升高［11］。這些研究表明，NOX4是誘導(dǎo)DR氧化應(yīng)激和血視網(wǎng)膜屏障分解的關(guān)鍵分子。

舒洛地特（sulodexide，SDX）由80%的低分子肝素和20%的硫酸皮膚素構(gòu)成，屬于葡糖胺聚糖（glycosaminoglycans，GAGs）［12］。臨床研究顯示，SDX 干預(yù)的糖尿病患者視網(wǎng)膜的滲漏減少［13］，提示SDX具備治療DR的潛能。在體外實驗中，SDX在內(nèi)皮細胞中抑制高糖誘導(dǎo)的ROS生成和炎癥因子分泌［14］，提示SDX可能具有抑制NOX等酶活性的作用。

本研究旨在探索SDX對糖尿病視網(wǎng)膜尤其是視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞的影響及其潛在機制。本課題組前期研究提示SDX干預(yù)減輕了DR小鼠的視網(wǎng)膜滲漏，NLRP3炎癥小體也同時減少［15］。因此，本研究重點關(guān)注SDX抑制NLRP3炎癥小體活化的機制。

材料和方法

1 動物與細胞

6周齡的C57BL/6小鼠購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（粵）2013-0002，飼養(yǎng)于廣東省動物監(jiān)測所。人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMECs；cap-0010）購于Angio-Proteomie。

2 主要試劑

小鼠抗人和小鼠NLRP3多克隆抗體（1∶1 000，AG-20B-0014-C100）購自Adipogen；兔抗人NOX4單克隆抗體（1∶1 000，ab133303）、兔抗人Pro Casp-1+p10+p12多克隆抗體（1∶1 000，ab179515）、兔抗人VE-Cad多克隆抗體（1∶1 000，ab333168）及兔抗人和小鼠ZO-1多克隆抗體（1∶1 000，ab59720）購自Ab-cam；Alexa Fluor?488偶聯(lián)的同工凝集素（isolectin）GS-IB4（1∶5 000，I21411）購自Invitrogen。

3 主要方法

3.1 實驗動物模型建立 6周齡的C57BL/6小鼠分為對照（control，Con）組和DM組，分別接受10%脂肪飼料或60%高脂飼料。4周后DM組和Con組小鼠分別用40 mg/kg鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）和等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液腹腔注射，連續(xù)注射5 d后隨機血糖高于16.7 mmol/L者為糖尿病模型造模成功。

3.2 舒洛地特治療 造模成功后隨即進行為期3個月的藥物干預(yù)，用隨機數(shù)法將小鼠分為DM+SDX組、DM+生理鹽水（normal saline，NS）組、Con+SDX組及Con+NS組。DM+SDX組和Con+SDX組腹腔注射SDX（10 mg/kg），而DM+NS和Con+NS組腹腔注射等體積生理鹽水，每2 d一次，持續(xù)12周。

3.3 伊文思藍尾靜脈注射 通過尾靜脈給小鼠注射30 mg/kg的伊文思藍，隨后將小鼠靜置于37℃熱毯上2 h。直接摘取小鼠右側(cè)眼球在4%多聚甲醛中固定15 min后進行鋪片，觀察視網(wǎng)膜血管滲漏情況（激發(fā)波長620 nm，發(fā)射波長740 nm）。用37℃的PBS進行心臟灌注后剝離左側(cè)視網(wǎng)膜于甲酰胺中，在冰上超聲裂解后于70℃水浴18 h，500 000×g離心45 min，取上清液于620 nm波長檢測吸光度（A）。

3.4 HRMECs處理 用125、250、500和1 000 LSU/L（LSU即lipasemic unit，脂酶單位）4個濃度的SDX處理HRMECs 24 h。陰性對照siRNA（si-NC）和沉默NOX4的siRNA（si-NOX4）用于轉(zhuǎn)染HRMECs。對照腺病毒（ad-GFP）和過表達NOX4的腺病毒（ad-NOX4）以MOI=20感染細胞。

3.5 Western blot 上樣量30 μg，轉(zhuǎn)膜后用7%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜后用I抗孵育8～16 h（I抗稀釋比例見“2 主要試劑”），其后用II抗于4℃孵育3 h，洗膜后用ECL法顯影，用ImageJ軟件分析條帶灰度。

3.6 免疫熒光技術(shù) 用4%多聚甲醛室溫固定切片或細胞10 min，PBST浸洗后用溶于1%BSA的0.2%Triton X-100在室溫下固定破膜1 h，再用PBST浸洗；加入I抗，濕盒中4℃孵育過夜；其后用PBST浸洗，加入Alexa Fluor?555偶聯(lián)或Alexa Fluor?647偶聯(lián)的熒光II抗室溫孵育1 h，浸洗后封片拍攝。

3.7 ROS檢測 用DCFH-DA探針試劑盒檢測細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS。細胞種在48孔板或者96孔板里，進行相應(yīng)處理后，在黑暗中與10 μmol/L的DCFH-DA反應(yīng)30 min，然后用PBS洗滌兩次。隨后可在酶標(biāo)儀和熒光顯微鏡中檢測或觀察ROS產(chǎn)生的情況。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，統(tǒng)計結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（mean±SEM）表示。實驗均重復(fù)3次及以上。符合正態(tài)分布及方差齊性的兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）及 Bonferroni’s post hoc test。不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用秩和檢驗進行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SDX減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏

DM+NS組與DM+SDX組在SDX治療前后血糖無顯著差異，見圖1A。視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，DM+NS小鼠的視網(wǎng)膜微血管滲漏較Con+NS組顯著增加，而DM+SDX組的視網(wǎng)膜滲漏較DM+NS組顯著減少（P＜0.05），見圖1B、E。另外，我們發(fā)現(xiàn)DM+NS組的微血管密度較Con+NS組下降，而DM+SDX組相比于DM+NS組，微血管密度顯著上升（P＜0.05），見圖1C、F。HE染色結(jié)果提示，神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)量在DM+NS組中顯著減少，而DM+SDX組較DM+NS組增多（P＜0.05），見圖1D、G。

2 SDX減輕糖毒性引起的內(nèi)皮細胞損傷

Western blot結(jié)果顯示，ZO-1在DM+NS組小鼠視網(wǎng)膜組織中的表達量下降，而DM+SDX組的ZO-1表達量較DM+NS組顯著上升（P＜0.05），見圖2A。在HRMECs中，高糖刺激明顯降低了ZO-1和VE-Cad的表達，而在高糖刺激同時加入SDX的HRMECs中，ZO-1和VE-Cad的表達水平顯著提高（P＜0.05），見圖2B。細胞免疫熒光結(jié)果提示，高糖處理的HRMECs之間VE-Cad減少，而SDX與高糖共處理的HREMCs之間VE-Cad表達部分恢復(fù)（P＜0.05），見圖2C。

3 舒洛地特在體內(nèi)抑制高糖導(dǎo)致的NLRP3炎癥小體激活

Western blot結(jié)果提示，NLRP3、Pro Casp-1及其活化狀態(tài)的剪切體（cleaved Casp-1）在DM+NS組中升高，而在DM+SDX組比DM+NS組顯著下降（P＜0.05），見圖3A。NLRP3和GS-IB4共染的視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示，NLRP3在視網(wǎng)膜上的表達與GS-IB4高度吻合，提示NLRP3主要在血管內(nèi)皮中表達；NLRP3在DM+NS組中升高，而在DM+SDX組比DM+NS組下降（P＜0.05），見圖3B。

Figure 1.Intraperitoneal injection of sulodexide（SDX）protected diabetic mouse retinas from blood-retina barrier breakdown，vascular leakage，reduction of microvascular density and loss of ganglion cells.A：blood glucose of mice（n=15～20）；B and E：representative images（B；the upper scale bar=1 μm；the lower scale bar=100 μm）and quantification（E；n=3） of retinal vascular leakage（indicated by with arrows）；C and F：representative images（C；scale bar=25 μm）and quantification（F：n=7～10）of microvascular density.D and G：HE staining of retinal sections at the analogous positon of eyeballs（D；scale bar=25 μm）and quantification of ganglion cell number（G；n=12～18）.GCL：ganglion cell layer；INL：inner nuclear layer；ONL：outer nuclear layer；RPE：retinal pigmented epithelium.Mean±SEM.*P＜0.01 vs Con+NS group；#P＜0.05 vs DM+NS group.圖1 SDX治療減輕糖尿病小鼠視網(wǎng)膜微血管滲漏，提高微血管密度及神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)

4 SDX在HRMECs中抑制高糖導(dǎo)致的NLRP3炎癥小體激活

Western blot結(jié)果顯示，125 LSU/L的SDX處理對HRMECs的NLRP3和Pro Casp-1表達無明顯影響，因此后續(xù)實驗選用最低有效濃度250 LSU/L處理細胞，見圖4A。細胞免疫熒光結(jié)果顯示，高糖處理下，HRMECs中的NLRP3和NOX4表達都顯著升高，而高糖與SDX同時處理的HRMECs中NLRP3和NOX4表達下降；Pearson相關(guān)系數(shù)統(tǒng)計結(jié)果都顯示，高糖處理時HRMECs中NLRP3和NOX4的共定位明顯增加，在額外添加SDX處理時顯著下降（P＜0.05），見圖4B。

5 SDX在HRMECs中減少NOX4誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化

Figure 2.SDX inhibited high glucose（HG）-induced degradation of junction proteins in both diabetic mouse retinas and HRMECs.A：Western blot analysis and densitometry quantification of zonula occludens-1（ZO-1）in retinas；B：Western blot analysis and densitometry quantification of ZO-1 and VE-cadherin（VE-Cad）in HRMECs；C：representative images（scale bar=100 μm）and mean fluorescence density of VE-Cad in HRMECs.Mean±SEM.n=6.*P＜0.01 vs Con+NS group or Man（5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol）group；#P＜0.05 vs DM+NS group or HG（30 mmol/L glucose）group.圖2 SDX在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜和HRMECs中均能抑制高糖誘導(dǎo)的連接蛋白降解

Western blot結(jié)果顯示，高糖處理使HRMECs中NOX4和NLRP3炎癥小體組分的表達均增加，其下游分子IL-1β的表達也增加；敲減NOX4后以上蛋白在HRMECs中的表達都顯著下降（P＜0.05），見圖5A。同樣，我們觀察到無論是在正常糖還是高糖狀態(tài)，過表達NOX4都引起了NLRP3的表達顯著上升，而SDX處理降低了NOX4、NLRP3和cleaved Casp-1蛋白水平（P＜0.05），但Pro Casp-1蛋白水平始終沒有統(tǒng)計學(xué)意義的變化，見圖5B。

6 SDX在HRMECs中抑制NOX4介導(dǎo)的ROS生成

ROS在高糖處理下明顯增加，而高糖與SDX共處理顯著降低了ROS的生成（P＜0.05），見圖6A、D。敲減NOX4后，ROS的生成顯著降低（P＜0.05），見圖6B、E。相反，過表達NOX4使HRMECs的ROS生成明顯升高，而過表達NOX4后再加入SDX處理，ROS的生成顯著下降（P＜0.05），見圖6C、F。

7 SDX在HRMECs中抑制NOX4誘導(dǎo)的連接蛋白降解

在高糖處理下，HRMECs中NOX4表達升高，而ZO-1和VE-Cad都明顯下降，而敲減NOX4后，ZO-1和VE-Cad都顯著升高（P＜0.05），見圖7A。相反，過表達NOX4無論是在正常糖還是高糖狀態(tài)使ZO-1和VE-Cad表達減少，而過表達NOX4后再用SDX處理，則部分抑制了NOX4表達的同時也部分恢復(fù)了ZO-1和VE-Cad在 HRMECs中的表達（P＜0.05），見圖7B。

討 論

NLRP3炎癥小體的激活與DR中內(nèi)皮細胞的損傷關(guān)系密切。本研究實驗結(jié)果表明，在糖尿病小鼠視網(wǎng)膜中，NLRP3炎癥小體的成分顯著升高，確證了DR小鼠視網(wǎng)膜的炎癥反應(yīng)。視網(wǎng)膜鋪片結(jié)果顯示NLRP3和血管內(nèi)皮標(biāo)志物GS-IB4高度共定位，提示視網(wǎng)膜的NLRP3升高主要是在內(nèi)皮細胞中，這讓我們更加確信NLRP3炎癥小體的激活與DR中內(nèi)皮功能的損傷及血管滲漏有關(guān)。

多個研究表明高糖刺激可以誘發(fā)內(nèi)皮細胞的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)［16］。ROS是激活NLRP3炎性小體的重要中間分子［17］。在糖尿病狀態(tài)下，NOX4產(chǎn)生的ROS可以引起內(nèi)皮損傷，使用抗氧化劑或NOX抑制劑抑制了糖尿病小鼠的視網(wǎng)膜滲漏［18］，提示NOX/ROS對DR的血管滲漏有負面影響。我們的研究提示NOX4/ROS可以激活NLRP3炎癥小體，而抑制ROS可減輕由IL-1β引起的炎癥反應(yīng)［19］。我們認為在高糖刺激下，HRMECs的炎癥反應(yīng)至少有一部分要歸咎于NOX4/ROS/NLRP3通路的激活，同時本研究也為NLRP3及其下游、NOX4等作為DR治療的靶點提供了依據(jù)。

Figure 4.SDX inhibited high glucose（HG）-induced NLRP3 inflammsome activation in HRMECs.A：Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，NLRP3，procaspase-1（Pro Casp-1）and cleaved caspase-1（cleaved Casp-1）；B：representative images（scale bar=25 μm）and colocalization ratio of immunofluorescence staining of NOX4 and NLRP3.Mean±SEM.n=3.*P＜0.01 vs Man group；#P＜0.05 vs HG group.圖4 在HRMECs中，SDX抑制高糖誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活

內(nèi)皮細胞是通過連接蛋白，如ZO-1和VE-Cad等相互銜接的，內(nèi)皮細胞間的連接對于維持內(nèi)皮通透性非常重要［20］。研究表明，NLRP3炎癥小體的激活會導(dǎo)致內(nèi)皮間連接蛋白的降解［21］。與報道一致，我們在糖尿病小鼠中觀察到了ZO-1的降低，在高糖處理的HRMECs中觀察到了ZO-1和VE-Cad的降低，與NLRP3的變化呈相反趨勢。有研究提示IL-1β降低了血管內(nèi)皮細胞之間ZO-1和claudin-5的黏附強度，導(dǎo)致血管通透性增加［22］，因此IL-1β也許是研究NLRP3與ZO-1等內(nèi)皮細胞間連接蛋白關(guān)系的切入點。總之，NOX4/ROS/NLRP3通路的抑制對DR具有保護作用。

Figure 5.SDX inhibited NOX4-induced NLRP3 inflammsome activation in HRMECs.Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，NLRP3，procaspase-1（Pro Casp-1）and cleaved caspase-1（cleaved Casp-1）were shown.A：the cells were treated with 5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol（Man）+negative control siRNA（si-NC），Man+NOX4 siRNA（si-NOX4），30 mmol/L glucose（HG）+si-NC or HG+si-NOX4；B：the cells were treated with Man+control adenovirus（Ad-GFP），Man+adenovirus carrying NOX4 gene（Ad-NOX4），Man+Ad-NOX4+SDX，HG+Ad-GFP，HG+Ad-NOX4 or HG+Ad-NOX4+SDX.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；△P＜0.05 vs Man+Ad-GFP group；▲P＜0.05 vs HG+Ad-GFF group；+P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.圖5 在HRMECs中，SDX抑制NOX4誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活

研究報道減少ROS可減輕糖尿病的癥狀［23］；NOX家族也被視為治療DR的靶點之一［24］。SDX既往被報導(dǎo)具有抑制炎癥和抗氧化的作用，具體機制未闡明［25］。而我們的研究結(jié)果表明，SDX干預(yù)可抑制由高糖引起的NOX4/ROS/NLRP3通路激活，從而保護內(nèi)皮間連接蛋白；動物實驗也表明，SDX干預(yù)顯著減少糖尿病小鼠視網(wǎng)膜滲漏。此外，神經(jīng)節(jié)細胞在DR中降解也是損害視力的原因之一，我們在糖尿病小鼠中觀察到SDX抑制了由糖尿病引起的節(jié)細胞數(shù)量下降，提示SDX不僅對HRMECs有保護作用，可能還對視網(wǎng)膜中其他的細胞有保護作用。因此，SDX可以被考慮用作治療DR。但是，SDX作為糖萼保護劑是否直接作用于NOX4仍有待研究。

Figure 6.SDX inhibited NOX4-mediated ROS generation in HRMECs.The representative images and quantification of ROS generation were shown.A and D：the cells were treated with 5.5 mmol/L glucose and 24.5 mmol/L mannitol（Man），30 mmol/L glucose（HG），HG+125 LSU/L SDX（SDX125）or HG+250 LSU/L SDX（SDX250）；B and E：the cells were treated with Man+negative control siRNA（si-NC），Man+NOX4 siRNA（si-NOX4），HG+si-NC or HG+si-NOX4；C and F：the cells were treated with Man+control adenovirus（Ad-GFP），Man+adenovirus carrying NOX4 gene（Ad-NOX4），Man+Ad-NOX4+SDX，HG+Ad-GFP，HG+Ad-NOX4 or HG+Ad-NOX4+SDX.Mean±SEM.n=5.▲P＜0.05 vs Man group；&P＜0.05 vs HG group；*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；$P＜0.05 vs HG+Ad-GFP group；△P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.圖6 在HRMECs中，SDX抑制NOX4介導(dǎo)的ROS生成

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)SDX通過抑制NOX4/ROS/NLRP3通路減輕HRMECs的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，從而保護連接蛋白ZO-1和VE-Cad，以減輕DR中的微血管滲漏（圖8）。本研究為SDX應(yīng)用于DR治療提供了新的證據(jù)。

Figure 7.SDX attenuated NOX4-induced damage of junction proteins in HRMECs.Western blot analysis and densitometry quantification of NOX4，ZO-1 and VE-Cad were shown.A：knockdown of NOX4；B：over-expression of NOX4.Mean±SEM.n=3.*P＜0.05 vs Man+si-NC group；#P＜0.05 vs HG+si-NC group；△P＜0.05 vs Man+Ad-GFP group；▲P＜0.05 vs HG+Ad-GFF group；&P＜0.05 vs HG+Ad-NOX4 group.圖7 在HRMECs中，SDX通過抑制NOX4減少高糖對連接蛋白的損傷

Figure 8.A proposed schematic diagram of how sulodexide（SDX）protects human retinal microvascular endothelial cells（HRMECs）with high glucose stimulation.NADPH oxidase 4（NOX4）-derived reactive oxygen species（ROS）facilitate the activation of nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3（NLRP3）inflammasome and further destroy zonula occludens-1（ZO-1）and VE-cadherin（VE-Cad）after high glucose treatment.Our study indicates that SDX suppresses expression of NOX4，thus inhibiting NOX4-derived ROS and NOX4-induced NLRP3 activation.Our study also provides evidence that SDX protects ZO-1 and VE-Cad in response to glucotoxicity or NOX4 over-expression.This suggests that SDX may alleviate leakage in diabetic retinas via inhibiting NOX4/ROS/NLRP3 pathway.ASC：apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain；Casp-1：caspase-1；IL-1β：interleukin-1β.圖8 SDX保護HRMECs的示意圖