禽白血病的檢測與診斷

徐麗　田宇杰　岑永秀　黃飛

禽白血病（AvianLeucosis）是由禽白血病病毒（AvianLeukosisVirus，ALV）和禽肉瘤病毒（AvianSarcomaVirus，ASV）群中的病毒感染引的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱。該病毒能夠引起許多種具有傳染性的良性和惡性腫瘤。根據(jù)臨床癥狀可分為淋巴細(xì)胞性白血?。↙LV）、成髓細(xì)胞白血?。ˋMV）、成紅細(xì)胞性白血?。ˋEV）、髓細(xì)胞樣白血病、結(jié)締組織腫瘤和骨硬化病等。大多數(shù)禽白血病引起的腫瘤與造血系統(tǒng)有關(guān)，少數(shù)損傷其他組織。

1.ALV的臨床癥狀

ALV感染的雞群產(chǎn)生的臨床癥狀和病理變化多種多樣的，從生長遲緩、產(chǎn)蛋率下降、免疫抑制等亞臨床表現(xiàn)，直至典型的腫瘤發(fā)生和死亡。感染雞的表現(xiàn)與毒株、感染年齡及雞的遺傳性等密切相關(guān)。在實(shí)際病例中內(nèi)臟腫瘤、體表皮膚血管瘤或其它組織的腫瘤較少，更多的病例表現(xiàn)為生產(chǎn)性能下降和免疫抑制導(dǎo)致的免疫失敗。實(shí)際上，這種亞臨床作用帶來的經(jīng)濟(jì)損失可能大于病例的腫瘤性死亡帶來的損失。

具有典型癥狀的發(fā)病雞被剖檢后，可見其內(nèi)臟器官肝、脾、腎等有不同程度的腫大現(xiàn)象，且器官表面常出現(xiàn)灰白色的腫瘤結(jié)節(jié)。通過病理學(xué)觀察，其他組織，如肺臟、心肌間質(zhì)、卵巢基質(zhì)等部位常常會彌散分布有腫瘤細(xì)胞，腺胃壁及法氏囊間隙偶爾會伴有髓樣細(xì)胞瘤的出現(xiàn)?；疾?yán)重者，其組織便會縮小或消失。

2.ALV的檢測與診斷

通過臨床癥狀和剖檢變化對ALV感染的進(jìn)行初步診斷，對疑似病例可以通過腫瘤的鑒定和組織病理學(xué)檢查初步診斷，然而馬立克氏病和淋巴細(xì)胞白血病這兩種最常見的淋巴腫瘤性疾病很容易混淆，并且大部分感染雞僅有部分亞臨床癥狀，此外，REV有時(shí)也會導(dǎo)致雞產(chǎn)生淋巴細(xì)胞性腫瘤，使ALV的鑒別診斷更加困難。因此，需要通過病毒的分離鑒定、血清學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)檢測等方法進(jìn)一步確診。

（1）病毒的分離鑒定

禽白血病毒既可以在雞胚成纖維細(xì)胞上培養(yǎng)，也可以在DF-1細(xì)胞上培養(yǎng)。用DF-1細(xì)胞時(shí)只有外源性ALV生長，而用CEF細(xì)胞可能有內(nèi)源性ALV的假陽性，鑒定需用群特異性抗體做IFA或通過測序劃分亞群。病毒分離鑒定的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可分離和保存流行株以進(jìn)一步做致病性試驗(yàn)。其缺點(diǎn)是技術(shù)要求高，成本高，周期長。

（2）血清學(xué)檢驗(yàn)

①簡介免疫熒光（IFA）

該方法用于確定雞或雞群是否被外源性ALV-A/B或ALV-J感染過，其優(yōu)點(diǎn)是方法簡單、可大批量檢測，通常代表外源病毒感染;缺點(diǎn)是與當(dāng)前感染狀態(tài)無直接關(guān)系，不能用于鑒別診斷。該方法主要用于流行病學(xué)調(diào)查或種雞群凈化狀態(tài)的判斷依據(jù)之一，常用于判定SPF雞群有無感染。

②酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

通過ELISA方法檢測雞群中ALV-J的抗原或抗體陽性率在生產(chǎn)上已成為主要的方法。用單克隆抗體建立的夾心ELISA具有很高的特異性。這種方法尤其適用于大批量樣品的檢測。用原核細(xì)胞高效表達(dá)的ALV-JJL-2株gp85基因產(chǎn)物為抗原建立了檢測抗體的間接ELISA方法，具有較高的特異性和敏感性，重復(fù)性和穩(wěn)定性好。但由于不同地區(qū)ALV-J流行株gp85基因及其分子變異存在著不同的規(guī)律，因此該方法可能只適用于檢測地方流行株。如果gs抗原（P27）ELISA檢測呈陽性，則需進(jìn)一步用ALV-J亞群抗血清作中和試驗(yàn)，確定其是否為ALV-J亞群病毒，防止檢出的是樣品中的內(nèi)源性病毒的gs抗原。如果是基于P27抗原的檢測，則最好多次隨機(jī)取樣進(jìn)行檢測后才能鑒定，因?yàn)殡u群被外源性病毒感染后，在一定時(shí)期內(nèi)P27的陽性結(jié)果將急速上升，而存在內(nèi)源性病毒的雞群P27陽性率相對保持穩(wěn)定（通常維持在一個(gè)很低的百分點(diǎn)）。

ELISA操作簡便，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好，耗時(shí)較短，作為一種有效的普查方法在臨床實(shí)際中應(yīng)用較為廣泛，常用于定期對種禽群進(jìn)行ALV檢測和凈化。但因?yàn)槌Ｄ芡瑫r(shí)檢測出內(nèi)源性的ALV，檢測結(jié)果中常有假陽性的出現(xiàn)。

{3}病毒中和試驗(yàn)（NT）

一個(gè)亞群中的ALV只能被同亞群中的ALV抗體所中和，而不被其他亞群的特異性抗體所中和，因此用J亞群特異性抗體或抗血清可以鑒定ALV-J。利用ALV-J病毒中和試驗(yàn)檢測雞群，可以在感染雞的血清中檢測到ALV-J的抗體。然而，NT試驗(yàn)操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)料，臨床診斷時(shí)很少應(yīng)用，且該方法不易于規(guī)范化和制度化，故也不適合于進(jìn)口雞群的檢測。

{4}瓊指擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（AGP）

20世紀(jì)80年代，哈爾濱獸醫(yī)研究所研究出用羽髓檢測ALV的瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)，適用于現(xiàn)場大面積應(yīng)用，曾在中國的種雞凈化中發(fā)揮了巨大作用。但是瓊擴(kuò)試驗(yàn)的敏感性較差，并有一定的假陽性出現(xiàn)。

（3）核酸分子檢測方法

①PCR及RT-PCR

PCR可檢測出ALV-J前病毒DNA，包括來自血液、腫瘤組織、病毒感染的組織或細(xì)胞培養(yǎng)物的樣本。PCR方法的敏感性比ELISA方法高出5倍。PCR方法可以檢測出ELISA抗體陰性雞體內(nèi)ALV-J，可能原因是雞體內(nèi)缺乏可以用ELISA方法檢出的相應(yīng)抗體。但PCR方法受到ALV-J的env基因序列和正常雞群中同源基因的干擾，另外還受到抗原變異性的困擾，這使得PCR的使用變得越來越復(fù)雜。由于ALV-J的多變性，至今還沒有找到一對引物可通過PCR檢出所有J亞群病毒通過RT-PCR可以檢測ALV病毒RNA。

②實(shí)時(shí)定量PCR

Kim等利用實(shí)時(shí)熒光探針RT-PCR對J亞群病毒RNA定量化，同時(shí)將其結(jié)果與（Qc）-RT-PCR、傳統(tǒng)定量法（TCID50）和抗原捕獲ELISA法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR法特異性非常強(qiáng)，易于操作，重復(fù)性好。

③環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

Zhang等以普通水浴鍋和3對特異性LAMP引物建立了一種ALV-J的LAMP檢測技術(shù)，其敏感性比普通PCR高10倍，陽性率要比PCR高。因其可以在1h左右完成試驗(yàn)過程，所以具有快速的特點(diǎn)，同時(shí)操作簡便，無需昂貴設(shè)備，因此適用于臨床快速診斷。

（作者單位：561000貴州省安順市西秀區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局動物疫病預(yù)防控制中心）