葡萄牙牡蠣(Crassostrea angulata)六種化學(xué)成分近紅外定量模型的建立

黃冠明，郭 香，祁劍飛，寧 岳，巫旗生，王曉清*，曾志南*，朱禮艷

1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128 2. 福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361013 3. 福建安井食品股份有限公司中心實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門 361028

引 言

葡萄牙牡蠣(Crassostreaangulata)又名福建牡蠣，屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、雙殼綱(Bivalvia)、珍珠貝目(Pterioida)、牡蠣科(Ostreidae)、巨蠣屬(Crassostrea)，其食物鏈較短、生長(zhǎng)迅速、產(chǎn)量高，且經(jīng)濟(jì)效益好[1]，是福建省海水貝類養(yǎng)殖的主要種類。牡蠣味道鮮美，并富含蛋白質(zhì)及多種微量元素，為人們提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)源，是一種深受歡迎的海產(chǎn)品。隨著生活水平的提高，消費(fèi)者更加看重牡蠣的營(yíng)養(yǎng)和風(fēng)味，選育營(yíng)養(yǎng)好、口感佳的牡蠣新品種，在水產(chǎn)消費(fèi)市場(chǎng)有著很大的需求。目前，葡萄牙牡蠣遺傳育種的研究主要集中在種間雜交[2-3]，快速生長(zhǎng)新品系和殼色新品種的選育等方面，曾志南等[4]通過(guò)連續(xù)數(shù)代的群體選育，培育出了金黃殼色速長(zhǎng)葡萄牙牡蠣新品系，其生長(zhǎng)速度明顯高于普通群體，通過(guò)對(duì)該品系體成分的研究分析發(fā)現(xiàn)，該新品系水分、糖原、鋅、鐵的含量明顯高于普通群體，高糖原含量的牡蠣普遍口感更佳，但新品系粗蛋白、鈣的含量顯著低于普通群體[5]，同時(shí)觀測(cè)到，高銅、鋅含量的葡萄牙牡蠣中牛磺酸的含量也明顯較高。一直以來(lái), 國(guó)內(nèi)外都未見(jiàn)有關(guān)牡蠣肉質(zhì)性狀選育工作的報(bào)道，原因是對(duì)肉質(zhì)性狀進(jìn)行選育時(shí)，需要對(duì)大量樣本的成分指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)分析，而傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)檢測(cè)方法存在耗時(shí)費(fèi)力、成本高、污染環(huán)境等缺點(diǎn)[6]。

近紅外光譜技術(shù)(near-infrared spectroscopy, NIRS)是一種敏感、高效、低成本、無(wú)污染的新型定量分析技術(shù)，能夠?qū)ν粯颖局械亩囗?xiàng)化學(xué)指標(biāo)進(jìn)行快速準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)，在食品[7]、醫(yī)藥[8]、選擇育種[9]等方面有廣泛的應(yīng)用。目前，在水產(chǎn)育種領(lǐng)域，近紅外光譜技術(shù)僅對(duì)長(zhǎng)牡蠣(Crassostreagigas)中蛋白質(zhì)、糖原的含量有較準(zhǔn)確的預(yù)測(cè)[10]，但尚未見(jiàn)用于分析葡萄牙牡蠣生化成分的報(bào)道。本研究對(duì)105份采自4個(gè)時(shí)間段，6個(gè)產(chǎn)地的葡萄牙牡蠣樣本進(jìn)行冷凍干燥處理，避免牡蠣軟體部高水分含量對(duì)近紅外光譜分析的影響，建立了能夠快速準(zhǔn)確測(cè)定葡萄牙牡蠣中蛋白質(zhì)、糖原、?；撬?、鋅、硒、鈣6種體成分含量的近紅外光譜模型，對(duì)今后選育肉質(zhì)性狀佳的葡萄牙牡蠣新品系提供了技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

自2018年6月至2019年3月，三個(gè)月為一間隔，分別從福建福州、石獅、詔安，廣東汕頭、湛江，廣西防城港6個(gè)產(chǎn)地，共采集105份葡萄牙牡蠣樣本。單個(gè)牡蠣軟體部濕重(除去閉殼肌)為0.28～2.33 g, 根據(jù)開(kāi)殼后牡蠣肉的大小，分為大個(gè)體樣本組和小個(gè)體樣本組，每份樣本濕重30～50 g。

將新鮮葡萄牙牡蠣開(kāi)殼，取軟體部，用剪刀剪去閉殼肌后稱重，按大小分組后放入50 mL離心管, 并將離心管置于冰盒中。先用剪刀將離心管中的牡蠣肉剪碎，然后用手持式勻漿機(jī)調(diào)至最大轉(zhuǎn)速勻漿60 s，在-80 ℃冰箱中保存12 h后，使用真空冷凍干燥機(jī)干燥48 h。用研缽和研杵將干燥后的樣本研磨至細(xì)粉末，然后用60目篩網(wǎng)篩分, 樣本顆粒越均勻細(xì)小，越利于提高模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確度[12]。將每份樣本分成兩份，一份用于近紅外光譜的采集，一份用于6種成分化學(xué)真實(shí)值的測(cè)定。

1.2 儀器

傅里葉近紅外(NIR)光譜儀(Thermo Fisher，AntarisⅡ, USA)，采集軟件RESULT-Integration(Thermo Fisher，USA)，數(shù)據(jù)分析軟件TQ Analyst(Thermo Fisher，USA)，全自動(dòng)凱氏定氮儀(FOSS，Kjeltec 8400, Sweden)，可見(jiàn)分光光度計(jì)(Shimadzu，UVmini-1240, Japan)，液相色譜儀(Shimadzu, LC-16, Japan)，火焰原子吸收分光光度計(jì)(Varian, AA240FS, USA), 雙道原子熒光儀(北京吉天，AFS-930, China), 真空冷凍干燥機(jī)(CHRIST, Alpha 2-4 LDplus，Germany), 手持式勻漿機(jī)(IKA T10 basic ULTRA-TURRAX，Germany)。

1.3 光譜采集

近紅外光譜儀開(kāi)機(jī)預(yù)熱30 min后, 將準(zhǔn)備好的樣品放入光譜儀配套的石英杯，樣品厚度1 cm，將軟件設(shè)置為漫反射光譜，光譜掃描范圍在10 000～4000 cm-1，掃描次數(shù)為64次，分辨率為8 cm-1，吸收光譜用log(1/R)表示，其中R表示反射率。在采集每個(gè)樣品之前，先采集背景光譜以消除背景所帶來(lái)的影響。

1.4 化學(xué)真實(shí)值測(cè)定

葡萄牙牡蠣中蛋白質(zhì)、?；撬?、鋅、硒、鈣含量測(cè)定采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》、GB 5009.169—2016《食品中?；撬岬臏y(cè)定》、GB 5009.14—2017《食品中鋅的測(cè)定》、GB 5009.93—2017《食品中硒的測(cè)定》、GB 5009.92—2016《食品中鈣的測(cè)定》的方法，糖原含量測(cè)定采用試劑盒法(EnzyChromTM糖原試劑盒，BioAssay Systems，USA)。

1.5 模型建立與驗(yàn)證

采用TQ Analyst軟件，選用偏最小二乘法(PLS)，以及乘法散射校正(MSC)、一階求導(dǎo)、Norris平滑的光譜預(yù)處理方法，并選擇軟件自動(dòng)推薦的波段范圍，剔除異常樣本。模型采用外部驗(yàn)證和交叉驗(yàn)證的方法對(duì)模型預(yù)測(cè)效果進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證樣本數(shù)量為總樣本數(shù)的1/3。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)成分測(cè)定結(jié)果

采用國(guó)標(biāo)法和試劑盒法對(duì)105份葡萄牙牡蠣干粉樣本的蛋白質(zhì)、糖原、牛磺酸、鋅、硒、鈣含量進(jìn)行測(cè)定。分析結(jié)果如表1所示，蛋白質(zhì)含量分布范圍為30.60%～68.00%，糖原3.00%～48.10%，?；撬?.80%～27.60%，鋅0.11%～2.21%，硒1.36%～6.91%，鈣1.09%～11.70%，可見(jiàn)樣本中6種成分含量的分布范圍廣，有較強(qiáng)代表性，滿足了近紅外定量模型要求樣本成分含量分布范圍廣的基本要求。

表1 葡萄牙牡蠣樣本中蛋白質(zhì)、糖原、?；撬帷\、硒、鈣含量分析結(jié)果

Table 1 Statistics of protein, glycogen, taurine, zinc, selenium and calcium contents ofCrassostreaangulatasamples

蛋白質(zhì)糖原牛磺酸鋅硒鈣最大值/%68.0048.1027.602.216.9111.70最小值/%30.603.007.800.111.361.09平均值/%51.6218.5216.250.742.693.19標(biāo)準(zhǔn)偏差/%9.0611.694.700.501.032.11總樣本數(shù)105105105105105105

2.2 原始光譜分析

用近紅外光譜儀采集了105份樣本原始光譜，如圖1所示，光譜曲線走向基本一致，但不同樣本的光譜曲線又略有不同，說(shuō)明各樣本成分含量有差異。由于部分樣本采集光譜時(shí)正處于南方梅雨季節(jié)，實(shí)驗(yàn)室濕度較大，導(dǎo)致采集的原始光譜在7 500～7 000和5 500～5 000 cm-1附近的水峰區(qū)域有噪聲干擾，圖譜質(zhì)量受到了水汽影響。

圖1 葡萄牙牡蠣樣本的原始光譜圖Fig.1 The raw spectra of Crassostrea angulata samples

2.3 預(yù)處理光譜分析

如圖2所示，原始光譜通過(guò)乘法散射校正(MSC)、一階求導(dǎo)、Norris平滑的光譜預(yù)處理方法，消除了由于樣本顆粒大小等原因引起的光譜信號(hào)基線漂移及噪聲等問(wèn)題[12]，減少了圖譜中的不均勻散射效應(yīng)，提高了信噪比(SNR)。

圖2 乘法散射校正、一階求導(dǎo)結(jié)合Norris平滑F(xiàn)ig.2 MSC+1st derivative+Norris derivative filter

2.4 模型的確立和外部驗(yàn)證

選擇TQ Analyst軟件自動(dòng)推薦的光譜波段范圍(如表2)，建立了6種成分的近紅外定量分析模型，并對(duì)模型進(jìn)行了外部驗(yàn)證。

蛋白質(zhì)定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)為0.985 3，校正均方根誤差(RMSEC)為1.62，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.985 1，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為1.59(如圖3)。

糖原定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)為0.965 1，校正均方根誤差(RMSEC)為3.19，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.963 6，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為3.17(如圖4)。

?；撬岫磕Ｐ偷男Ｕ嚓P(guān)系數(shù)(RC)為0.950 4，校正均方根誤差(RMSEC)為1.14，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.944 1，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為1.05(如圖5)。

鋅定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)為0.955 4，校正均方根誤差(RMSEC)為0.156，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.946 1，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為0.153。

硒定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)為0.920 0，校正均方根誤差(RMSEC)為0.290，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.919 0，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為0.289。

圖3 蛋白質(zhì)化學(xué)真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系圖Fig.3 Protein chemical value and predictive valueof correlation diagram

圖4 糖原化學(xué)真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系圖Fig.4 Glycogen chemical value and predictivevalue of correlation diagram

圖5 ?；撬峄瘜W(xué)真實(shí)值與預(yù)測(cè)值的相關(guān)關(guān)系圖Fig.5 Taurine chemical value and predictive valueof correlation diagram

鈣定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)為0.925 2，校正均方根誤差(RMSEC)為0.929，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)為0.924 1，預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)為1.03。

以上6個(gè)定量模型的校正相關(guān)系數(shù)(RC)均高于或等于0.92，預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(RP)均高于0.91，模型預(yù)測(cè)值與化學(xué)真實(shí)值有很高的的相關(guān)度，且校正均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測(cè)均方根誤差(RMSEP)都在可接受范圍，6個(gè)近紅外定量模型都有著較好的預(yù)測(cè)效果，尤其蛋白質(zhì)、糖原、?；撬?、鋅定量模型的預(yù)測(cè)效果特別令人滿意。由此可見(jiàn)，此次建模適用于今后葡萄牙牡蠣體成分的實(shí)際檢測(cè)。

2.5 模型的交叉驗(yàn)證

通過(guò)軟件對(duì)6個(gè)模型進(jìn)行了交叉驗(yàn)證，得到以下結(jié)果：

蛋白質(zhì)定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.981 7，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為1.81。

糖原定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.946 1，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為3.95。

牛磺酸定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.900 5，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為1.61。

鋅定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.897 5，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為0.233。

硒定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.875 3，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為0.360。

鈣定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)為0.829 2，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)為1.39。

以上6個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，交叉驗(yàn)證均方根誤差(RMSECV)都在可接受范圍，交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)(RCV)除了鈣的結(jié)果不夠理想，其余均高于0.87，預(yù)示模型有著較好的預(yù)測(cè)效果，但鈣的近紅外定量模型今后還有可優(yōu)化空間。

3 結(jié) 論

實(shí)驗(yàn)樣本采集時(shí)長(zhǎng)9個(gè)月，葡萄牙牡蠣樣本來(lái)自于6個(gè)不同產(chǎn)地，且樣本量足夠大，具有較好的代表性，樣本經(jīng)過(guò)冷凍干燥處理，減少了水分對(duì)光譜質(zhì)量的影響，有利于提高模型的準(zhǔn)確性及穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)所建立的6個(gè)近紅外定量模型，有著較高的校正相關(guān)系數(shù)和預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)，可見(jiàn)模型具有較好的預(yù)測(cè)效果，近紅外光譜技術(shù)適用于葡萄牙牡蠣中蛋白質(zhì)、?；撬?、鋅、硒、鈣含量的檢測(cè)。但鈣定量模型的交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)稍低，還需對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)一步提高其實(shí)際預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

本模型的建立，對(duì)今后開(kāi)展大規(guī)模葡萄牙牡蠣體成分的測(cè)定，選育肉質(zhì)性狀佳的葡萄牙牡蠣新品系有著重要意義。