佛山地區(qū)無(wú)精子癥及嚴(yán)重少精子癥患者Y 染色體微缺失基因分析

吳智剛 李煒煊 李啟欣 李小藍(lán)

不育是現(xiàn)有衛(wèi)生疾病中較為常見(jiàn)的一種類(lèi)型,嚴(yán)重影響到世界各國(guó)的人口增長(zhǎng)。遺傳因素導(dǎo)致男性不育中Y 染色體微缺失占據(jù)主要地位［1,2］。其中,位于Y 染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)側(cè)端的無(wú)精子因子(Azoospermia factors,AZF)區(qū)域出現(xiàn)缺失是遺傳學(xué)導(dǎo)致男子生精障礙的主要因素。但現(xiàn)階段對(duì)Y 染色體AZF 區(qū)域基因微缺失情況,仍未獲得相對(duì)明確的數(shù)據(jù)［3］。本研究中選取嚴(yán)重少精子癥、無(wú)精子癥患者作為研究對(duì)象,并選取50 例精液參數(shù)正常的男性作為對(duì)照進(jìn)行研究,旨在分析Y 染色體長(zhǎng)臂微缺失對(duì)嚴(yán)重性少精子癥以及無(wú)精子癥男性不育患者的影響以及相關(guān)性,為臨床男性生精障礙不育患者的治療奠定醫(yī)學(xué)基礎(chǔ),現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年1～9 月本院泌尿科門(mén)診接治的300 例原發(fā)性男性不育患者作為研究對(duì)象,按照疾病分型不同分為嚴(yán)重少精子癥組(200 例)及無(wú)精子癥組(100 例),同時(shí)選取50 例可正常產(chǎn)生精子的男性作為正常組。本研究已通過(guò)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核準(zhǔn)許。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)臨床診斷及精液檢查后確診為嚴(yán)重少精子癥或無(wú)精子癥者；無(wú)精神障礙,具備良好的溝通能力。

1.2 方法

1.2.1 血液樣本采集 所有研究對(duì)象均提取2 份5 ml骨髓或者外周血,利用肝素進(jìn)行抗凝全血后,分別用于核型分析以及全血DNA 提取［4］。

1.2.2 染色體核型 取一份血液樣本加入5 ml 含小牛血清的培養(yǎng)液,充分混勻后置于37℃條件下的培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,持續(xù)3 d 后按照常規(guī)操作進(jìn)行染色體標(biāo)本制備,進(jìn)行G 顯帶,在油鏡下對(duì)100 個(gè)淋巴細(xì)胞進(jìn)行分析。

1.2.3 外周血基因組DNA 提取 根據(jù)Axygen biosciences 公司提供的方法步驟將另一份血液標(biāo)本進(jìn)行外周血粒細(xì)胞基因組DNA 提取。

1.2.4 Y 染色體微缺失檢測(cè) 選取位于Y 染色體長(zhǎng)臂AZFa 區(qū)、AZFb 區(qū)、AZFc 區(qū)、AZFd 區(qū)各兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),各區(qū)域的位點(diǎn)依次為sY86、sY84、sY127、sY134、sY254、sY255、SY152、SY153,采用多重聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)合Taqman 技術(shù),檢測(cè)研究對(duì)象DNA 中AZF 微缺失,同時(shí)以鋅指蛋白基因(ZFX/ZFY,SY238)和睪丸決定因子(SRY)作為內(nèi)參照。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增及檢測(cè) 外周血基因組DNA 模板采用梯度聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增反應(yīng),采用2%瓊脂糖凝膠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行水平電泳,應(yīng)用凝膠成像分析系統(tǒng)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析。

1.2.6 精液質(zhì)量檢測(cè) 所有研究對(duì)象需進(jìn)行精液檢測(cè),禁欲3～7 d 到院檢查,手淫取精2～6 ml,7 d 后復(fù)查,取兩次平均值［5］。

1.3 觀察指標(biāo) 比較三組的Y 染色體長(zhǎng)臂區(qū)微缺失情況、正常組與嚴(yán)重少精子癥組的精子密度和精子活力(a 級(jí)精子、a+b 級(jí)精子)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組Y 染色體長(zhǎng)臂區(qū)微缺失情況對(duì)比 嚴(yán)重少精子癥組、無(wú)精子癥組AZF 區(qū)缺失率分別為11.50%、22.00%,均明顯高于正常組的4.00%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 正常組與嚴(yán)重少精子癥組的精子密度和精子活力對(duì)比 正常組的精子密度(32.72±14.37)×106/ml 高于嚴(yán)重少精子癥組的(15.06±13.27)×106/ml,精子活力中a 級(jí)、a+b 級(jí)精子分別為(24.87±6.51)%、(41.38±11.04)%均高于嚴(yán)重少精子癥組的(12.48±6.86)%、(29.56±14.96)%,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表1 三組Y 染色體長(zhǎng)臂區(qū)微缺失情況對(duì)比［n(%)］

表2 正常組與嚴(yán)重少精子癥組的精子密度和精子活力對(duì)比()

表2 正常組與嚴(yán)重少精子癥組的精子密度和精子活力對(duì)比()

注：與正常組對(duì)比,aP＜0.05

3 討論

世界衛(wèi)生組織進(jìn)行一項(xiàng)關(guān)于不孕不育夫婦不孕原因的調(diào)查,結(jié)果顯示近15%的不孕不育夫婦中近一半是因男性原因?qū)е拢?］。而引發(fā)男性不育癥的主要原因中接近1/3 是因先天性遺傳異常導(dǎo)致精子生成障礙,進(jìn)而引發(fā)不孕不育。AZF 區(qū)域的基因缺失情況存在一定差異,AZF 區(qū)域中的任何基因出現(xiàn)微缺失均可造成男子生精障礙的疾病問(wèn)題。

李翠等［7］研究指出當(dāng)男性患者出現(xiàn)AZFa 區(qū)缺失時(shí),其臨床表現(xiàn)主要為支持細(xì)胞綜合征,若缺失基因位于AZFb 區(qū)域,則會(huì)表現(xiàn)為精子生成障礙,患者的精子在精母細(xì)胞階段停止發(fā)育,最為常見(jiàn)的缺失類(lèi)型為AZFc 缺失,相應(yīng)誘發(fā)的臨床癥狀為少精子癥。亐開(kāi)興等［8］研究指出患有唯支持細(xì)胞綜合征的患者,在出現(xiàn)無(wú)精子癥狀的同時(shí)會(huì)出現(xiàn)AZFb、AZFc 區(qū)域部分缺失以及AZFa 區(qū)完全缺失的情況,若存在以上情況即使采用經(jīng)皮穿刺附睪抽吸取精術(shù)、睪丸精子穿刺獲取精子的幾率也非常?。?］。本項(xiàng)研究采用多重PCR 技術(shù)對(duì)200 例嚴(yán)重少精子癥患者、100 例無(wú)精子癥患者、50 例無(wú)生精障礙的男性進(jìn)行研究對(duì)比,分析其Y 染色體長(zhǎng)臂AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd 區(qū)的缺失情況,結(jié)果顯示嚴(yán)重少精子癥組、無(wú)精子癥組AZF 區(qū)缺失率分別為11.50%、22.00%,均明顯高于正常組的4.00%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。與以上結(jié)論相符。本研究中,正常組的精子密度高于嚴(yán)重少精子癥組,精子活力中a 級(jí)、a+b 級(jí)精子均高于嚴(yán)重少精子癥組,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。證實(shí)AZF 區(qū)域確實(shí)影響男子的精子生成,進(jìn)而降低男性的精液質(zhì)量,引發(fā)不育。包毅剛等［10］研究后得出一致結(jié)論。

綜上所述,及時(shí)到院檢測(cè)Y 染色體長(zhǎng)臂AZF 區(qū)微缺失情況可從基因角度明確生精障礙原因,有利于相應(yīng)治療措施的制定,減少醫(yī)療支出,有效避免藥物、手術(shù)治療對(duì)身體造成的損傷,緩解子代遺傳缺陷負(fù)荷,為優(yōu)生優(yōu)育提供可靠的依據(jù),值得臨床推廣。