不飽和脂肪酸經(jīng)氧化反應(yīng)形成反式脂肪酸機(jī)理研究進(jìn)展

姚夢瑩 梁 倩 崔巖巖 黃午陽 鄭曉燕 張偉敏

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，?？?570228)(江蘇省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所2，南京 210014)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯嶒炚?，?？?570101)

食用油中順式不飽和脂肪酸在熱加工過程中可經(jīng)異構(gòu)化反應(yīng)形成反式脂肪酸(trans fatty acids, TFAs)[1，2]。食用油中TFAs種類和含量在160～240 ℃內(nèi)隨溫度的升高和時間的延長而呈指數(shù)增加趨勢[3-5]。眾多研究表明，膳食TFAs與糖尿病、心血管疾病、肥胖、乳腺癌、前列腺癌、不孕和冠心病等疾病密切相關(guān)[6]；大量食用含有TFAs 的食物會阻礙必需脂肪酸在人體內(nèi)的正常代謝、妨礙脂溶性維生素的吸收和利用、使細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)變得脆弱、加速動脈硬化等多種危害[7-11]。隨著對 TFAs 危害認(rèn)識的深入，歐美等國家對 TFAs 加以限制，制定膳食中限量標(biāo)準(zhǔn)。因而，有效控制食用油熱加工過程中TFAs 的產(chǎn)生成為亟需解決的難題，且對于提升食品安全水平和保障消費(fèi)者健康至關(guān)重要。

1 TFAs特點與影響因素

如油酸甲酯、亞油酸甲酯和亞麻酸甘油三酯在160～220 ℃加熱條件下生成TFAs含量隨加熱溫度升高和加熱時間延長而逐漸增加[19]。大豆油、菜籽油和葵花油等植物油也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果[20-23]。此外，TFAs的形成與不飽和脂肪酸組成、含量、結(jié)構(gòu)、飽和度及碳原子數(shù)目多少有關(guān)。其中不飽和度越高TFAs越易形成；當(dāng)碳原子數(shù)目、不飽和度相同時，反式異構(gòu)數(shù)量越少、對稱性越高的TFAs 越容易產(chǎn)生[24]。

2 不飽和甘油三酯氧化產(chǎn)生反式結(jié)構(gòu)的反應(yīng)機(jī)理

油脂中不飽和脂肪酸的氧化反應(yīng)又可分為自動氧化和熱氧化兩種，自動氧化和熱氧化二者反應(yīng)機(jī)理相同[25]。但兩種反應(yīng)發(fā)生的過程、反應(yīng)速度和產(chǎn)物則不盡相同。一般而言，100 ℃以下以自主氧化反應(yīng)為主；100～200 ℃則會加速氧化反應(yīng)，并伴隨熱異構(gòu)化反應(yīng)(150 ℃條件就有TFAs產(chǎn)生)[26]；溫度在 200～300 ℃時則以熱聚合反應(yīng)為主，而熱分解反應(yīng)在260 ℃以下不明顯，在350 ℃以上時反應(yīng)速度會明顯加快[27]。

2.1 不飽和甘油三酯自由基反應(yīng)(加成-消除反應(yīng))產(chǎn)生反式脂肪酸機(jī)理

早期的研究證明，不飽和脂肪酸在含硫自由基(RS*)、烷基自由基(ROO*)等自由基在催化作用下可通過自由基反應(yīng)機(jī)制發(fā)生雙鍵的順/反異構(gòu)化[28,29]。X*與雙鍵經(jīng)α-加成和β消除反應(yīng)生成π鍵，最后生成熱穩(wěn)定的反式異構(gòu)體(圖1)，反應(yīng)過程中會形成一個由外源自由基和不飽和脂肪酸組成的加合物[29]。不飽和脂肪酸在自由基的催化作用下亦可以通過自由基反應(yīng)機(jī)制發(fā)生雙鍵的順反異構(gòu)化產(chǎn)生TFAs。反式異構(gòu)化速率與順式熱降解速率呈正相關(guān)，熱致異構(gòu)化反應(yīng)與熱氧化降解產(chǎn)生的中間物質(zhì)和氧化過程有關(guān)[11,30,31]。

圖1 自由基催化順式/反式異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)制

圖2 雙自由基過渡態(tài)反應(yīng)機(jī)制[33]

2.2 不飽和甘油三酯自動氧化產(chǎn)生反式結(jié)構(gòu)的反應(yīng)機(jī)理

從油酸甲酯自動氧化生成過氧自由基的機(jī)理可以看出(圖3)，油酸順/反異構(gòu)化反應(yīng)理論計算和實驗證明，氧氣是發(fā)生油酸順/反異構(gòu)化反應(yīng)的必要條件，R—O—O—H 均裂的活化能為160.97 kJ/mol，是油酸順/反異構(gòu)化過程的決速步驟，并從油酸角度闡明了不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)形成自由基經(jīng)過β均裂產(chǎn)生TFAs的理論機(jī)制[34]。Porter等[35]對油酸甲酯自動氧化生成過氧自由基機(jī)理的研究表明，油酸發(fā)生順/反異構(gòu)化過程中，8t、9t、10t及11t結(jié)構(gòu)均有產(chǎn)生，這些反式異構(gòu)體的產(chǎn)生及產(chǎn)量受到加熱、溫度和時間等諸多因素的影響。同理，TFAs也是亞油酸和亞麻酸熱氧化分解反應(yīng)中的常見氧化產(chǎn)物。只不過生成TFAs更容易，產(chǎn)物更復(fù)雜，除了有TFAs之外，還伴隨有經(jīng)環(huán)化反應(yīng)形成的一環(huán)和二環(huán)脂肪酸單體等產(chǎn)物[36]。目前關(guān)于不飽和脂肪酸在高溫條件下生成環(huán)狀脂肪酸的化學(xué)機(jī)制最為成熟的解釋是熱引發(fā)[1,6]或[1,7]質(zhì)子異變迀移協(xié)同的環(huán)加成作用[36]。和油酸類似，亞油酸也是通過自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)機(jī)制和1, 3-單鍵轉(zhuǎn)移重排(分子內(nèi))可以解釋亞油酸在高溫條件下形成9t、11t亞油酸和成10t、12t式亞油酸，只是亞油酸比油酸相對更容易形成反式亞油酸[37,38]。由于本研究主要側(cè)重于對不飽和脂肪酸形成TFAs機(jī)制的探討，因而對不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和α-亞麻酸)在發(fā)生順/反異構(gòu)化過程經(jīng)高溫反應(yīng)形成環(huán)狀脂肪酸的具體化學(xué)機(jī)制不做過多贅述。

注：Rc H 是油酸， Rt H 是反式油酸， H 是與雙鍵相鄰的α -亞甲基的氫原子。圖3 油酸自動氧化產(chǎn)生反式結(jié)構(gòu)的反應(yīng)機(jī)理

3 熱致異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)理的密度泛函理論計算

3.1 密度泛函理論可開展酚類抗氧化劑活性理論分析

化學(xué)反應(yīng)過渡態(tài)理論認(rèn)為，不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化過程形成的過渡態(tài)性質(zhì)非?；顫?，存在時間極短，從實驗獲得它的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等數(shù)據(jù)很難[5]。而量子化學(xué)密度泛函理論則為不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化機(jī)制研究提供了可能，并在分子反應(yīng)機(jī)理和過渡態(tài)的處理上體現(xiàn)出了無與倫比的優(yōu)越性[16,39-43]。近年來，國內(nèi)外學(xué)者報道了利用量子化學(xué)手段研究不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞麻酸)的順反異構(gòu)化機(jī)制[5,16,38,42]。

3.2 不飽和脂肪酸氧化脫氫反應(yīng)能量的量子化學(xué)計算

食用油中不飽和脂肪酸或甘油酯中的α碳上的氫原子發(fā)生脫氫而在起始階段產(chǎn)生脂烷基自由基。十八碳一烯酸(油酸)有2個α碳原子(即C8和C11)；十八碳二烯酸(亞油酸) 應(yīng)當(dāng)有3個α碳原子，即C8、C11和C14，但是由于C11受到兩個雙鍵的影響，它的活性要比C8和C14要強(qiáng)得多；作為十八碳三烯酸(亞麻酸) 有4個α碳原子，結(jié)果氧化反應(yīng)將受C11和C14的支配。熱、金屬催化劑、紫外線和可見光可以加速脂肪酸或甘油酯自由基形成，從脂肪酸或甘油酯中脫氫所需的能量取決于分子中氫的位置。

表1 脂肪酸自動氧化形成的氫過氧化物[47]

3.3 不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化理論機(jī)制量子化學(xué)計算

眾多研究表明，不飽和脂肪酸甘油三酯經(jīng)產(chǎn)生自由基(α-自由基)而使雙鍵發(fā)生cis/trans異構(gòu)化，主要包含直接異構(gòu)化和質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化2種反應(yīng)機(jī)理[30,36,48]。Li等[21]利用量子化學(xué)密度泛函理論(DFT)對油酸(C18∶1)經(jīng)質(zhì)子轉(zhuǎn)移途徑的cis/trans異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)制的理論推理和試驗結(jié)果表明，順式油酸在145.46 ℃下發(fā)生了焓變(放熱現(xiàn)象)，順式和反式油酸基態(tài)能量差為7.6 kJ/mol，其值低于順式和反式亞油酸(C18∶2)能量差(13.2 kJ/mol)。油酸發(fā)生順/反異構(gòu)化的過渡態(tài)能壘為294.5 kJ/mol，其值大于亞油酸(284.2 kJ/mol或286.4 kJ/mol)[21]。李安[5]對油酸順反異構(gòu)化反應(yīng)理論的研究表明，油酸異構(gòu)化按照直接異構(gòu)化反應(yīng)理論包含1種過渡態(tài)和1條途徑。Cheng等[34]對油酸順/反異構(gòu)化反應(yīng)理論計算和實驗證明，油酸順/反異構(gòu)化反應(yīng)需要氧氣參與并可能開始于150 ℃，從油酸角度闡明了不飽和脂肪酸發(fā)生氧化反應(yīng)形成自由基經(jīng)過β均裂(ROOH均裂的活化能為160.97 kJ/mol)產(chǎn)生TFAs的理論機(jī)制。Tsuzuki[22]的研究也證實了這一理論機(jī)制。按照直接異構(gòu)化反應(yīng)理論，順式亞油酸需克服236.9 kJ/mol以上的能壘形成雙自由基渡態(tài)，且反式雙鍵越多，所需克服的能壘數(shù)量越多；反應(yīng)溫度越高，速率常數(shù)越大。而按照質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化理論，單一反應(yīng)途徑需克服286.4 kJ/mol的能壘，過渡態(tài)中間產(chǎn)物為一個包含3個碳原子和4個氫原子的π34離域體系[5]。根據(jù)質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化機(jī)理，亞麻酸分子中的氫原子向相鄰的碳原子轉(zhuǎn)移形成過渡態(tài)產(chǎn)物，單獨(dú)的反應(yīng)途徑需要達(dá)到 290.4 kJ/mol 的能量，包含有3個過渡態(tài)和1個中間體，過渡態(tài)的中間產(chǎn)物體系為一個具有4個氫原子和3個碳原子的大離域體系[5,16]。

4 熱致異構(gòu)化反應(yīng)途徑與動力學(xué)

4.1 熱致異構(gòu)化反應(yīng)途徑和模式

不飽和甘油三酯的雙鍵在高溫氧化反應(yīng)過程中會發(fā)生斷裂所生成烯丙基自由基有可能成為TFAs形成的底物。理論上，不飽和脂肪酸在加熱條件下，隨著熱致異構(gòu)化反應(yīng)的發(fā)生，會按順序先生成單式異構(gòu)體，再生成雙反式異構(gòu)體，最后生成三反式的異構(gòu)體，形成一定分布情況的順反異構(gòu)化產(chǎn)物(反式油酸、反式亞油酸、反式亞麻酸)[16,17]。李安[5]研究表明，順式油酸分子的碳碳雙鍵經(jīng)一種過渡態(tài)、一條途徑進(jìn)行了非遷移的順反異構(gòu)化形成了反式油酸；亞油酸熱致異構(gòu)化按照直接異構(gòu)化反應(yīng)理論包含4個過渡態(tài)和2條途徑。亞麻酸熱致異構(gòu)化反應(yīng)根據(jù)直接異構(gòu)化的反應(yīng)機(jī)理，亞麻酸異構(gòu)化反應(yīng)需要包含6條途徑和12種過渡態(tài)[5,16]。賀凡[17]研究證實，亞油酸熱致異構(gòu)首先形成單反式 C18∶2-9c12t和 C18∶2-9t12c異構(gòu)體，再形成雙反式 C18∶2-9t12t異構(gòu)體。姜帆[16]實驗表明，α-亞麻酸甘油三酯熱致異構(gòu)途徑是：先形成C18∶3-9t, 12c, 15c、C18∶3-9c, 12t, 15c、C18∶3-9c, 12c, 15t單反式異構(gòu)體，再形成C18∶3-9c, 12t, 15t、C18∶3-9t, 12c, 15t、C18∶3-9t, 12t, 15c雙反式異構(gòu)體，最后形成C18∶3-9t, 12t, 15t三反式異構(gòu)體。通過以上研究初步闡明了不飽和甘油三酯熱致異構(gòu)化的反應(yīng)途徑和模式。

4.2 熱致異構(gòu)化反應(yīng)動力學(xué)

圖4 不飽和脂肪酸順反異構(gòu)化反應(yīng)能量途徑(油酸)

5 抗氧化劑抑制TFAs形成作用

不飽和脂肪酸熱致異構(gòu)化反應(yīng)由溫度主導(dǎo)，不飽和脂肪酸雙鍵在常溫下相對穩(wěn)定而很難發(fā)生順/反異構(gòu)化，而在足夠高溫度下則相對容易[56]。不飽和脂肪酸在 160～220 ℃條件下產(chǎn)生TFAs的含量隨加熱溫度升高和加熱時間延長而逐漸增加[17,19]。理論上，調(diào)控加熱溫度和縮短加熱時間是降低 TFAs 含量最簡單直接而又最有效的方法，以往有關(guān)抑制TFAs的方法主要集中在其形成抑制方面，尤其是在熱加工過程中如何采取各種措施以降低食品中TFAs的含量，如原料的改良、添加劑的使用、優(yōu)化加工工藝、改進(jìn)加工方法和設(shè)備等方面。但實際加工過程中當(dāng)溫度過低或處理時間不夠會降低食品的感官品質(zhì)(色澤、風(fēng)味、質(zhì)地和口感等)和安全性[17]。通過分析發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸(油酸、亞油酸和亞麻酸)熱致異構(gòu)化反應(yīng)屬于自由基反應(yīng)，其中無論是自由基反應(yīng)(自由基催化順式/反式異構(gòu)化、雙自由基扭轉(zhuǎn))、直接異構(gòu)化還是質(zhì)子轉(zhuǎn)移異構(gòu)化，其過渡態(tài)均包含自由基或者類似自由基的結(jié)構(gòu)。因而，在不改變加熱溫度和加熱時間的前提下，目前普遍認(rèn)為延緩和預(yù)防油脂的氧化酸敗工作量最低、最有效和最常見的方法是在油脂中添加抗氧化劑，以消除痕量自由基，阻止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而防止油脂氧化和TFAs產(chǎn)生。

Elisia等[58]研究認(rèn)為抗氧化劑中的羥基通過提供氫原子與酯自由基結(jié)合形成更穩(wěn)定的產(chǎn)物，從而阻止酯自由基鏈的持續(xù)氧化，實現(xiàn)降低甘油三酯熱致異構(gòu)過程形成的過量酯自由基，從而中斷或抑制自由基引起的油脂自動氧化反應(yīng)。因而添加自由基清除劑可抑制熱致異構(gòu)化反應(yīng)產(chǎn)TFAs[18]，而且抗氧化劑清除自由基能力越強(qiáng)，對TFAs 的抑制程度也越大[31]。目前普遍認(rèn)為延緩和預(yù)防油脂的氧化酸敗工作量最低、最有效和最常見的方法是在油脂中添加抗氧化劑，以消除痕量自由基，阻止鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，進(jìn)而防止油脂氧化和TFAs產(chǎn)生。傳統(tǒng)的人工合成抗氧化劑丁基羥基茴香醚(Butyl hydroxy anisol, BHA)、2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚 (Butylated hydroxytoluene, BHT)、特丁基對苯二酚(Tertiary butyllhydroquinone, TBHQ)和沒食子酸丙酯(Propyl gallate, PG)均在食用油中具有較好的抗氧化和抗異構(gòu)化效果[19,26,27,30,31]。但這些人工合成抗氧化劑具有潛在毒性甚至致癌，許多國家已禁止使用[60]。因此，從植物資源中尋找安全高效和熱穩(wěn)定性好的天然TFAs抑制劑是目前重要的發(fā)展方向和研究重點。近年來，維生素E(VE)、迷迭香提取物、茶多酚、芝麻酚、葉黃素、鼠尾草酸、茶多酚、谷維素和兒茶素等天然抗氧化劑均可有效抑制TFAs的形成[17,19,30,61]。然而有報道稱，維生素E、茶多酚和谷維素等多數(shù)天然抗氧化劑在高溫加熱條件下對TFAs形成的抑制作用效果并不理想，有些甚至還會對熱致異構(gòu)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)作用[5,17]。如茶多酚低于160 ℃穩(wěn)定性較好，隨著溫度的升高，其穩(wěn)定性顯著下降[62]；茶多酚、VE、VC、BHT和BHA 等常用抗氧化劑在約200 ℃高溫條件下的抗氧化效果明顯下降，而CA還能發(fā)揮穩(wěn)定的抗氧化性能[63]。TBHQ、茶多酚、阿魏酸乙酯和谷維素在高溫240 ℃加熱條件下對熱致異構(gòu)產(chǎn)物具有誘導(dǎo)作用[17]。賀凡[17]的研究結(jié)果顯示鼠尾草酸對TFAs(C18∶2-9c12t、C18∶2-9t12c和tt-CLAs)的形成具有顯著抑制作用但不影響CLAs的生成，可作為油脂熱致異構(gòu)化調(diào)控的選擇[17]。究其因，可能是因為多數(shù)天然抗氧化劑熱穩(wěn)定性較差，在食用油熱加工過程初期就發(fā)生了氧化降解，很難在食用油熱致異構(gòu)化反應(yīng)中清除活性羰基類化合物、活性氧族和脂質(zhì)自由基，阻斷TFAs的生成途徑。

6 結(jié)束語

由于熱致異構(gòu)化通常在較高溫度(150 ℃及以上)下發(fā)生，并非具有抗氧化作用的天然活性物質(zhì)一定具有抗異構(gòu)化作用。若要有效控制熱致異構(gòu)化反應(yīng)，天然TFAs抑制劑必須具備耐高溫、清除自由基活性強(qiáng)和對食品品質(zhì)影響小等特點。賀凡[17]研究結(jié)果表明，抗氧化劑對熱致異構(gòu)化反應(yīng)抑制作用與抗氧化活性成分的羥基氫、熱穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)和不飽和脂肪酸甘油三酯結(jié)構(gòu)及雙鍵的含量有關(guān)[17]。

目前鮮見關(guān)于利用密度泛函理論研究抗氧化劑抑制不飽和脂肪酸異構(gòu)化反應(yīng)機(jī)理的報道，有關(guān)密度泛函理論對鼠尾草酸、茶多酚、酚羧酸、維生素 E及合成抗氧化劑 BHA、BHT等典型的天然和合成酚類抗氧化劑以及黃酮類化合物清除自由基機(jī)理和不飽和脂肪酸異構(gòu)化機(jī)理的研究較多[5,38,42,46,65]，這些報道和研究為利用抗氧化劑抑制TFAs的形成提供了思路和借鑒。今后可以考慮從天然活性成分中尋找耐高溫、清除自由基活性強(qiáng)和對食品品質(zhì)影響小的抗氧化劑，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考慮從動力學(xué)和能量角度出發(fā)，結(jié)合密度泛函理論研究抗氧化劑抑制TFAS形成機(jī)制。此外，油脂熱降解、熱聚合和熱環(huán)氧化等反應(yīng)所產(chǎn)生油脂危害物質(zhì)(3-氯丙醇酯、縮水甘油酯、丙烯酰胺、極性物質(zhì)、苯并芘、呋喃和2-烷基呋喃等)物質(zhì)直接或間接與油脂熱氧化反應(yīng)相關(guān)，可以考慮加強(qiáng)對抗氧化劑抑制這些油脂熱加工過程產(chǎn)物形成作用研究，以便為油脂熱加工過程產(chǎn)物調(diào)控機(jī)制研究提供參考。