超聲-微波協(xié)同提取紫云英籽油及脂肪酸組成分析

蔣新龍 蔣益花 張雨生

(浙江樹人大學生物與環(huán)境工程學院，杭州 310015)

紫云英 (Astragalussinicus) 是豆科黃芪屬越年生草本植物，是南方稻區(qū)最主要種植和利用的綠肥作物，也是很好的蜜源植物與重要的青貯飼料原料來源[1]，還是美味蔬菜和制茶的原料，其根、莖、葉均具有一定的藥用價值[2，3]，其種子具有祛風明目之功效[4]。對于紫云英種子的研究主要集中在新品種選育與鑒定[5]和提高種子發(fā)芽率方法[6，7]。目前，關(guān)于紫云英籽油的研究鮮見報道。為了科學、充分地利用紫云英籽油資源，對微波-超聲協(xié)同輔助提取紫云英籽油工藝進行優(yōu)化，并通過GC分析其籽油脂肪酸組成，為進一步開發(fā)利用提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫云英籽：市售。采用OLYMPUS DP72顯微鏡觀測，基本上為腎形，種子平均千粒重為3.25 g。紫云英籽經(jīng)揀選、干燥、粉碎后制成40～60目籽粉，備用。37種脂肪酸混合標準品，其他試劑均為分析純。

CW-2000微波-超聲協(xié)同萃取儀，Agilent 7890B氣相色譜儀，UV-1600型紫外/可見分光光度計，AB204型分析天平，RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 紫云英籽油超聲-微波協(xié)同提取條件的優(yōu)化

1.2.1 提取方法

紫云英籽→除雜→烘干→粉碎→過篩→稱重→加提取溶劑→微波-超聲協(xié)同萃取→抽濾→旋蒸除去溶劑→干燥→紫云英籽油。

精密稱取3.000 0 g的籽原料，置于100 mL儀器專用萃取瓶中，加入適量溶劑后攪拌使樣品良好分散于溶劑中。將萃取瓶置于儀器萃取爐腔中，安裝好冷凝回流裝置，分別設(shè)置微波功率、提取時間等參數(shù)，檢查完畢后開啟微波及超聲(固定超聲條件：超聲輸出功率50 W，頻率40 kHz)進行萃取。萃取結(jié)束后進行減壓抽濾，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，濃縮物放恒溫鼓風干燥箱干燥(110 ℃加熱30 min)，精密稱量。每組實驗重復3次，取平均值。按公式計算紫云英籽油的出油率。

式中：M為紫云英籽的質(zhì)量/g；M2為空瓶質(zhì)量/g；M1為空瓶和紫云英籽油的質(zhì)量/g。

1.2.2 提取優(yōu)化實驗

理想提取溶劑的確定：分別以正己烷、石油醚(60～90 ℃)、丙酮、無水乙醇作為提取溶劑，在微波功率200 W，提取時間120 s，液料比10 mL·g-1的條件下進行萃取，以油脂品質(zhì)、出油率、溶劑價格、溶劑毒性為綜合考察指標，確定理想的提取溶劑。

單因子實驗：采用1.2.1超聲-微波協(xié)同提取法，提取條件：微波功率200 W、液料比10 mL·g-1，考察提取時間(60、90、120、150、180、210 s)對出油率的影響；提取時間150 s，液料比10 mL·g-1，考察微波功率(0、50、150、200、250、300 W )對出油率的影響；提取時間150 s、微波功率200 W，考察液料比(6、8、10、12、14、16 mL·g-1)對出油率的影響。

響應(yīng)面實驗：根據(jù)提取時間、液料比以及微波功率3個單因子實驗結(jié)果，確定響應(yīng)面實驗因素水平，見表1。用Design-Expert軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，選用Box-Behnken實驗設(shè)計，做3因素3水平共 17個實驗點(5個中心點)的響應(yīng)面分析實驗。

表1 響應(yīng)面方案設(shè)計因素水平表

1.3 紫云英籽油理化性質(zhì)分析

密度測定采用GB/T 5526—1985法；折光率測定采用GB/T 5527—2010法；酸價測定采用GB/T 5009.229-2016法；過氧化值測定采用GB 5009.227—2016法；碘值測定采用GB/T 5532—2008法；苯并(α)芘測定采用GB/T 22509—2008。平行3次，取平均值。

1.4 紫云英籽油的GC 成分分析

脂肪酸組成參照 GB/T 5009.168—2016的外標法，用Agilent 7890B氣相色譜儀進行GC 成分測定。

GC分析條件：色譜柱：CNW CD-2560(100 m×0.25 mm×0.20 μm)；檢測器類型：FID；檢測器溫度：260 ℃；進樣口溫度：250 ℃；進樣量：1 μL；升溫程序：130℃保持5 min，再以4 ℃/min的速率升溫至240 ℃并保持30 min；分流比∶10∶1；載氣流速：0.5 mL/min。

1.5 統(tǒng)計方法及分析軟件

以上指標均重復測定3次并取平均值，利用Origin8軟件作圖；應(yīng)用SPSS20.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，并用Duncan多重比較(SSR法)檢驗各處理平均數(shù)之間的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取優(yōu)化實驗

2.1.1 提取溶劑的選擇

傳統(tǒng)浸提方法所用的溶劑不一定適合微波輔助提取[8]。微波輔助技術(shù)是利用微波場的體積加熱和選擇性加熱的功能。微波輔助提取溶劑的選擇不僅要考慮相似相容規(guī)律，還要考慮微波高選擇性加熱特點。溶質(zhì)和溶劑的極性越大，對微波能的吸收越大，升溫越快，對萃取越有利[9]。表2結(jié)果表明：相同提取條件，出油率從大到小依次為石油醚、丙酮、無水乙醇、正己烷。從提取的油脂品質(zhì)考慮，石油醚和正己烷提取的油脂色澤淺、澄清度高，雜質(zhì)少。綜合各方面考慮選用石油醚(60～90 ℃)作為提取溶劑。

表2 不同有機溶劑對提取的比較

2.1.2 單因素實驗

圖1可知，紫云英籽油的出油率隨提取時間的延長而增大，提取時間為150 s時，紫云英籽油的出油率最高。謝明勇等[9]研究表明，在微波萃取過程中，一般加熱1～2 min即可達到所要求的萃取溫度，不同的物質(zhì)，最佳萃取時間不同。本實驗的最佳提取時間為150 s。

由圖1可知，隨微波功率的增大，紫云英籽油出油率不斷增大，當微波功率達到200 W時，紫云英籽油的出油率達到最高。微波功率越大，物料內(nèi)部溫度升高越快，局部壓力變大，導致細胞破裂，內(nèi)容物透過細胞壁流出并溶解到溶劑中的傳遞速度越快[10]。在微波功率達到 200 W 之后， 高微波功率導致的熱效應(yīng)使油分解或揮發(fā)，導致出油率有所減少[11]。

由圖1可知，隨著液料比的增加，紫云英籽油出油率不斷增大，在液料比達到10∶1mL·g-1時，出油率最高。提取溶劑用量的增加，增加了溶劑與紫云英籽細胞中油脂的濃度差，增加了傳質(zhì)推動力，從而提高了油脂在提取劑中的擴散速度。當溶劑用量增大到一定程度后，紫云英籽油的出油率逐漸減少，這是因為當溶劑過大時，相同時間提供的熱量被提取溶劑吸收的比例增加，空化效應(yīng)和機械效應(yīng)等作用的強度減弱，影響提取效率，而且溶劑用量過大，會造成溶劑回收困難和生產(chǎn)成本增加。由圖1可知，液料比10 mL/g較為適宜。

圖1 微波-超聲協(xié)同提取紫云英籽油單因子實驗結(jié)果

2.1.3 相應(yīng)面實驗

2.1.3.1 實驗結(jié)果

響應(yīng)面實驗數(shù)據(jù)見表3。

2.1.3.2 方差分析

響應(yīng)面實驗結(jié)果見表3。采用Designexpert軟件對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析，回歸結(jié)果見表4。從表4中可以看出，提取時間(A)的P<0.05，說明提取時間對籽油的提取影響顯著，微波功率(B)和液料比(C)P>0.05，說明微波功率和液料比對籽油的提取影響都不顯著。方差分析說明各個實驗因子對籽油的提取影響由大到小的順序依次為：提取時間(A)、液料比(C)、微波功率(B)。方差分析也說明各個具體實驗因子與響應(yīng)值都不是簡單的線性關(guān)系。

2.1.3.3 擬合模型的建立

對響應(yīng)面測試數(shù)據(jù)進行回歸擬合，確立回歸方程：Y/% =+31.41+0.46A+0.19B-0.22C+0.15AB+0.43AC+0.26BC-2.57A2-2.03B2-1.21C2

2.1.3.4 交互作用分析

在提取時間、液料比、微波功率3個因素中任取兩個作為X和Y，以出油率作為Z，作出相應(yīng)的三維曲面圖。相比而言，提取時間(A)和液料比(C)的交互作用較大，如圖2，表現(xiàn)為曲線比較陡，這與回歸分析的結(jié)果吻合。等高線的形狀也可反映出交互效應(yīng)的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。圖2可知，提取時間(A)和液料比(C)的交互作用較大。

2.1.3.5 最優(yōu)工藝驗證

利用軟件繪出回歸模型的等高線，并確定模型的極大值點，預測所得最大籽油出油率為31.45%。利用軟件得出籽油提取的最優(yōu)條件：微波功率204.41 W、液料比9.86 mL·g-1、提取時間152.54 s。

圖2 三維曲面和回歸模型等高線

結(jié)合實際實驗條件，得到最優(yōu)條件為微波功率204 W、液料比10 mL·g-1、提取時間152 s。根據(jù)實際最優(yōu)工藝進行驗證實驗，在此條件下測定籽油出油率，平行3次，得最大出油率為31.52%。根據(jù)預測最優(yōu)條件進行驗證實驗，實驗結(jié)果與預測值無顯著差異。根據(jù)GB/T 14772—2008粗脂肪測定方法，測得紫云英籽粗脂肪含量為32.16%，而本最優(yōu)工藝得最大出油率為31.52%，說明籽油基本上已經(jīng)提取完全，所以微波-超聲協(xié)同輔助法是短時高效提取紫云英籽油的方法。

2.2 紫云英籽油理化性質(zhì)

酸值是衡量油脂新鮮程度的指標，酸值越小，說明油脂中游離脂肪酸含量越小，油脂越新鮮[12]。由表5可知，紫云英籽油的酸值(KOH)為 2.61 mg/g，低于3.00 mg/g，符合GB/T 2716—2018食用植物油國家標準。過氧化值是衡量油脂被氧化的程度。長期食用過氧化值超標的油脂，對癌癥腫瘤、心血管病等慢性病有促進作用[13]。過氧化值數(shù)值越高，油品越差，紫云英籽油的過氧化值為7.72 mmol/kg，紫云英籽油的過氧化值低于食用植物油國家標準。碘值是判斷油脂脂肪酸不飽和程度的指標，紫云英籽油的碘值為130.2 gI/100 g，屬于干性油，說明紫云英籽油不飽和程度較高。此外，紫云英籽油相對密度為 0.899 0，所制紫云英籽油為澄清透明的黃色液體。以測定的理化指標判斷，紫云英籽油達到食用植物油國家標準。

表5 紫云英籽油理化特性

注：GB/T 2716—2018標準要求：酸值/mgKOH/g≤3；過氧化值/g/100 g≤0.25，即過氧化值/mmol/kg≤9.85。

2.3 紫云英籽油脂肪酸組成及含量分析

根據(jù)1.4方法，對紫云英籽油進行GC分析，紫云英籽油的脂肪酸組成分析結(jié)果見和表6。由表6可知，從紫云英籽油中共鑒定出20種脂肪酸，脂肪酸組成非常豐富。主要脂肪酸為亞油酸(37.58%)、亞麻酸(30.03%)、油酸(13.24%)、棕櫚酸(10.56%)、硬脂酸(3.48%)、芥酸(1.11%)，6種主要脂肪酸含量占95.99%。紫云英籽油不飽和脂肪酸含量為82.83%，以不飽和脂肪酸為主，這一結(jié)果驗證了紫云英籽油具有較高的碘值。

亞麻酸(ω-3)可代謝為人體必需的EPA和DHA，具有預防老年癡呆、抗炎、降糖、降壓等作用[14]。亞油酸(ω-6)是人體合成前列腺素的前體物質(zhì)，亞油酸的主要功效體現(xiàn)在預防心血管疾病上[15]。因為亞麻酸和亞油酸在人體中均接受不飽和化酶和碳鏈延長酶的作用，如果亞油酸攝入過量，會導致亞麻酸無法吸收[16]。亞油酸和亞麻酸比例過高將引起動脈緊縮、引發(fā)亞麻酸缺乏癥及多種退化性疾病。較低亞油酸和亞麻酸比例則有助于抗炎和抗癌[16]。中國營養(yǎng)學會在《中國居民膳食營養(yǎng)素參考攝入量》一文中提出亞油酸和亞麻酸適宜比例為(4～6)∶1[16-17]。當今人類飲食中亞油酸和亞麻酸比例已經(jīng)高達(10～30)∶1，文獻表明，ω-6/ω-3的最佳比值為1～4，ω-6 /ω-3比值降低，可以更好地減緩癌癥的發(fā)展，降低心血管疾病的風險，改善骨骼健康[18]。紫云英籽油中，亞油酸(ω-6)與α-亞麻酸(ω-3)的比值為1.25。紫云英籽油的攝入可以降低膳食中ω-6/ω-3脂肪酸的比值。紫云英籽油含有豐富的亞油酸與α-亞麻酸，而且具有較低的ω-6 /ω-3比值，因而具有較高的營養(yǎng)價值和開發(fā)利用價值。

表6 紫云英籽油脂肪酸組成

3 結(jié)論

在單因素實驗基礎(chǔ)上，運用響應(yīng)面設(shè)計的理論與方法，確定最佳提取工藝：石油醚為提取劑，提取時間152 s，微波功率204 W，液料比10 mL·g-1。在此條件下，紫云英籽油出油率為31.52%。經(jīng)方差分析和響應(yīng)面圖得知，在本實驗范圍內(nèi)，各因素對紫云英籽油提取率的影響作用大小順序為提取時間>液料比>微波功率，且提取時間對紫云英油的提取影響顯著，三因素之間的交互影響都不顯著。實驗證明，響應(yīng)面分析法可以有效地優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取法提取紫云英籽油的工藝條件。本實驗建立的優(yōu)化模型對紫云英籽油的開發(fā)利用具有指導意義。

紫云英籽油的理化指標達到GB / T 2716—2018《食品安全國家標準 植物油》。GC 分析得到紫云英籽油主要成分有油酸、亞油酸、亞麻酸、棕櫚酸、硬脂酸、芥酸，以多不飽和脂肪酸油酸為主，不飽和脂肪酸占82.83%。亞油酸(ω-6)與α-亞麻酸(ω-3)的比值為1.25。紫云英籽油具有較高的利用價值，可作為優(yōu)質(zhì)食用油源和功能性食用油開發(fā)利用。