不同預(yù)處理方式對海南山柚油感官特性及抗氧化抑菌作用的影響

郭海陽 譚海生 楊勁松 鄭小燕 盛占武

(海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，海口 570228)(海南大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院2，?？?570228)(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實驗站3，?？?570102)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，又名茶子樹、茶油樹，為山茶科(Theaceae)山茶屬(CamelliaL.)植物，是我國特有的一種極其珍貴的油料木本植物，種植、栽培歷史悠久，與油橄欖、油棕、椰子并稱為世界四大木本油料樹種[1-3]。在海南，油茶通常被稱為山柚，其籽所制得的油脂被稱為山柚油。海南山柚雖屬茶油中的一種，但是由于海南島獨特的地理環(huán)境，產(chǎn)出了品質(zhì)優(yōu)良的山茶籽，山柚油的特性有別于內(nèi)地，尤其口感和品質(zhì)較為特殊，其價格也是內(nèi)地油茶籽油的5～10倍[4]。馮棋琴等[5]采用頂空取樣GC-MS聯(lián)用技術(shù)發(fā)現(xiàn)山柚油主要揮發(fā)性風(fēng)味成分含量與內(nèi)地山茶油區(qū)別較大，山柚油中含量最高的為壬醛，且庚醛、1-辛烯-3-醇、正辛醛、2-正戊基呋喃、1-庚醇含量明顯高于內(nèi)地山茶油。

山柚油中的主要成分是油酸，所占總質(zhì)量分數(shù)高達75%左右，脂肪酸的組成也與橄欖油十分相似，而且山柚油中富含多種橄欖油中沒有的物質(zhì)，如茶皂素、茶多酚等，具有降低膽固醇和防輻射等作用[6]。據(jù)李麗等[7]的研究，山柚油中不皂化物含量少，易消化吸收，含有豐富的生育酚，對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、維持骨骼肌結(jié)構(gòu)和功能以及促進生育功能、增強機體免疫能力等方面都具有積極作用。根據(jù)陳梅芳等[8]的研究，茶油還能夠降低血脂、肝脂，并顯著延緩動脈粥樣硬化，對人體健康十分有益。山柚油營養(yǎng)成分含量豐富，而且還有很高的藥用價值，對消腫、止癢、刀傷、燙傷、撞傷有功效[9，10]。

油茶籽經(jīng)過烘烤、焙炒、微波等預(yù)處理，自身含有的蛋白質(zhì)、糖類、油脂在高溫有氧氣條件下會發(fā)生一系列化學(xué)反應(yīng)，加工工藝對山柚油的風(fēng)味、品質(zhì)和抗氧化活性有顯著影響。目前對山柚油的研究僅集中在其理化特性和組分分析上，對山柚油的抑菌功能及抗氧化功能特性研究甚少，而且鮮有關(guān)于預(yù)處理方式對山柚油品質(zhì)影響的研究。選擇適宜的預(yù)處理方法對優(yōu)化山柚油的提取工藝，提高茶油品質(zhì)十分必要[11]。因此，本研究采用焙炒、烘烤、微波等預(yù)處理方法處理油茶籽，經(jīng)壓榨所得的山柚油通過DPPH法、ABTS法以及羥基自由基清除率的測定，來分析評價經(jīng)過不同預(yù)處理的山柚油的抗氧化能力差異，以找出最適合山柚油的預(yù)處理方式，為今后海南油茶籽高值化加工技術(shù)的發(fā)展和高品質(zhì)、高附加值山柚油產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山柚籽：產(chǎn)自海南，含水量10%，含油量30%～40%。

ABTS[2，2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺鹽]、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)；二甲基亞砜、異丙醇等均為化學(xué)純；其他試劑均為分析純。

大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)：海南大學(xué)微生物實驗室保藏菌株。

1.2 儀器與設(shè)備

LTP205家用小型榨油機；WG70CTL20II-K6微波爐；KWS1530X-H7R格蘭仕電烤箱；APY-01大功率電磁爐；SW-CJ-17-D超凈工作臺；SKP-01電熱恒溫培養(yǎng)箱；UV-1100紫外可見分光光度計。

1.3 方法

1.3.1 山柚油茶籽的預(yù)處理及榨油流程

稱取200 g經(jīng)干燥脫殼后的山柚籽，平均分為4份，參考龍婷等[12]的方法，山柚分別進行焙炒、烘烤、微波處理，以未處理的山柚為未處理組，具體工藝流程：

焙炒處理：焙炒(將油茶籽在150 ℃下焙炒15 min，焙炒時注意避免油茶籽被炒糊、炒焦)→碾碎→壓榨→山柚油。

烘烤處理：烘烤(將油茶籽置于烘箱中，于120 ℃下烘烤30 min)→碾碎→壓榨→山柚油。

微波處理：微波(頻率2 450 MHz，功率700 W，間歇微波5次，每次2 min)→碾碎→壓榨→山柚油。

未處理(未處理組)：碾碎→壓榨→山柚油。

1.3.2 山柚油的感官評定方法

參考植物油感官分析方法[13]，結(jié)合山柚油的感官特點，分別從山柚油的色澤、香味、透明度、黏度對茶油進行感官評價。選擇30名具備相關(guān)專業(yè)知識的人員組成感官評定小組，并對成員進行感官分析培訓(xùn)。評價過程采取雙盲實驗方法，不告知主試實驗?zāi)康募安栌驼故卷樞颍瑢γ總€評價員按隨機順序展示經(jīng)過不同預(yù)處理的茶油，避免主試效應(yīng)對實驗結(jié)果產(chǎn)生影響，按表1進行感官評定。

表1 山柚油感官評分表

1.3.3 山柚油的抗氧化活性測定

1.3.3.1 山柚油清除DPPH·自由基能力的測定

首先選取新鮮榨好的山柚油使用無水乙醇進行梯度稀釋，將純山柚油稀釋至4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL。再準確稱量0.039 4 g DPPH·用無水乙醇定容至100 mL，再用無水乙醇稀釋為1×10-4mol/L的DPPH·溶液。利用溶液的特征紫紅色團在517 nm處的吸收峰，使用紫外可見分光光度計測定加入山柚油后A517吸收的下降表示茶油對有機自由基的清除能力，反應(yīng)總體積為4 mL[14]。將不同濃度的樣品分別取2.0 mL，與配制好的DPPH溶液等量混合，避光放置30 min進行反應(yīng)，以無水乙醇作為參比溶液測定517 nm波長下的吸光度的變化。并按照公式對抗氧化物質(zhì)的抑制率進行計算：

式中：A0為DPPH·與無水乙醇混合溶液在517 nm的吸光度；Ai為DPPH·與山柚油避光反應(yīng)30 min后的溶液在517 nm的吸光度；Aj為山柚油與無水乙醇混合溶液在517 nm處的吸光度。最后再根據(jù)測得的I來制作一元回歸方程以求得樣品對DPPH的半抑制濃度(IC50)。山柚油的抗氧化能力通過半抑制濃度IC50來表示，IC50越小，抗氧化能力越強。

1.3.3.2 山柚油對ABTS+·清除能力的測定

參考楊少輝等[15]的方法并稍加改進，將7.0 mmol/L ABTS溶液與2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等量混合，置于暗處反應(yīng)12 h得到ABTS+·。使用甲醇稀釋ABTS+·溶液，直到ABTS+·溶液在734 nm處吸光度為(0.70±0.02)。使用甲醇梯度稀釋山柚油樣品，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-甲醇溶液，取25 μL不同濃度的山柚油-甲醇溶液加入到2 mL的ABTS+·溶液中，靜置混合6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(Ai)。將25 μL甲醇溶液與2 mLABTS+·溶液中，靜置加入到ABTS混合6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(A0)。最后取2 mL甲醇溶液與25 μL樣品溶液混合，靜置6 min后測量混合液在734 nm處的吸光度(Aj)。重復(fù)測定3次，按照公式對抗氧化物質(zhì)的抑制率進行計算：

式中：A0為甲醇溶液與ABTS+·溶液混合后在734 nm處的吸光度；Ai為山柚油-甲醇溶液與ABTS+·溶液混合后在734 nm處的吸光度；Aj為甲醇溶液與山柚油-甲醇溶液混合后在734 nm處的吸光度。

根據(jù)所測得的抑制率來制作一元回歸方程，計算出抑制率在50%時的用量，即半抑制濃度(IC50)。以質(zhì)量濃度0.02 mg/mL的VC溶液為參照，通過比較二者的IC50的值來計算樣品相當于VC的用量，即VC當量(mg/mL VC)[16]。

1.3.3.3 山柚油對羥基自由基清除能力的測定

根據(jù)芬頓反應(yīng)(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH·)，用亞鐵離子作為催化體系，用雙氧水作為氧化劑的氧化反應(yīng)體系，可以在反應(yīng)中生成羥基自由基，根據(jù)與水楊酸-乙醇反應(yīng)體系的氧化情況，確定待測樣品能否對羥基自由基產(chǎn)生清除效果。在化學(xué)反應(yīng)過程中，二價鐵離子被其氧化成三價鐵離子可能發(fā)生混凝反應(yīng)從而生成沉淀[17]。測定步驟：

1)使用無水乙醇將4種不同預(yù)處理的山柚油進行梯度稀釋，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-無水乙醇溶液；

2)準確稱量0.083 4 g七水合硫酸亞鐵，用少量蒸餾水溶解，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，以制備6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液；

3)準確稱量0.041 4 g水楊酸，用少量無水乙醇溶解，然后轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用無水乙醇定容，以制備6.0 mmol/L的水楊酸-乙醇體系；

4)用移液槍準確量取30%濃度雙氧水溶液167 μL，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中用蒸餾水定容，以制備0.1%的雙氧水溶液；

5)按順序在10 mL試管中加入1 mL 6.0 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液，1 mL 6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液，不同濃度的茶油-無水乙醇溶液，最后加入0.8 mL雙氧水溶液，搖勻后放置于37 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30 min后離心，在3 500 r/min速度下離心10 min，取上清液在510 nm處測定其吸光度值，以無水乙醇取代雙氧水為對照組，以無水乙醇取代山柚油-乙醇溶液為空白組，重復(fù)測定3次。按公式對抗氧化物質(zhì)的抑制率進行計算：

式中：A0為無水乙醇代替山柚油-無水乙醇溶液的吸光度；Ai為山柚油-無水乙醇溶液反應(yīng)后的溶液的吸光度；Aj為無水乙醇代替雙氧水對照組的吸光度。

1.3.3.4 山柚油不同預(yù)處理自由基清除能力的顯著性分析

采用SPSS 22.0軟件對不同預(yù)處理方式的自由基清除能力進行t檢驗分析。

1.3.4 山柚油的抑菌功能測定

1.3.4.1 培養(yǎng)基的制備

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備：取牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂粉20.0 g用蒸餾水將溶質(zhì)搖動溶解，定容至1 000 mL后調(diào)pH至7.4～7.6，高壓蒸汽滅菌后進行倒平板操作，最后冷卻，放至4 ℃冷藏備用。

馬鈴薯淀粉培養(yǎng)基的制備：取39.0 g真菌用瓊脂培養(yǎng)基，用蒸餾水將溶質(zhì)搖動溶解，定容至1 000 mL后調(diào)pH至7.4～7.6，高壓蒸汽滅菌后進行倒平板操作，最后冷卻，放至4 ℃冷藏備用。

1.3.4.2 山柚油的稀釋

用5%無菌吐溫-80溶液將山柚油配制成體積分數(shù)為5%的山柚油母液。將母液稀釋10倍，然后連續(xù)采用7次二倍稀釋法，最終形成相當于母液濃度0.1×20、0.1×2-1、0.1×2-2、0.1×2-3、0.1×2-4、0.1×2-5、0.1×2-6、0.1×2-7的山柚油溶液[18]。

1.3.4.3 菌懸液的制備

將已活化的菌株分別取1.0 mL菌液入9.0 mL無菌水中，得到濃度為1×10-1的菌懸液置于振蕩器上振蕩1 min, 取該懸液菌1.0 mL入9.0 mL無菌水中，得到濃度為1×10-2的菌懸液，依次進行梯度稀釋，稀釋成濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6的菌懸液。

1.3.4.4 山柚油最低抑菌濃度(MIC)的測定

分別選取濃度為1×10-3、1×10-4、1×10-5的菌懸液進行涂布操作，涂布后，在每個平板中放置1個已滅菌的牛津杯，向其中注入50 μL稀釋過的山柚油，每個牛津杯中注入1種濃度的山柚油，小心將平板移至培養(yǎng)箱中放置，其中，大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，放置在37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，放置8 h后，每隔1 h觀察1次，測定抑菌圈大小。黑曲霉(Aspergillusniger)放置在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，放置32 h后，每隔1 h觀察1次，測定抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 山柚油感官分析評定結(jié)果與分析

將各預(yù)處理山柚油各項指標進行綜合評分，焙炒、烘烤、微波、未處理幾種山柚油的分數(shù)分別為3.49、3.80、4.11、3.14，可見，微波處理的綜合評分最高，并且對山柚進行適當?shù)念A(yù)處理有助于增加山柚油的風(fēng)味。

圖1 不同預(yù)處理方式所得山柚油的感官評價的QDA圖

采用定量描述分析法(QDA)對感官品質(zhì)進行分析，結(jié)果見圖1，經(jīng)過焙炒的山柚油雖然在黏度、色澤、透明度這幾方面評分略低，甚至低于未處理組的得分，但是其氣味和滋味的得分最高，經(jīng)過焙炒處理之后，山柚油表現(xiàn)出了一種特殊的香氣和滋味，并且呈現(xiàn)出的奶油味和堅果味相較其他幾種油更豐富，而且表現(xiàn)出的青草味、酸敗味等令人不愉悅的味道更淡。山柚在焙炒過程中，由于焙炒條件最為強烈，山柚的細胞壁被迅速破壞，由生變熟，香味得到釋放，因此香氣和滋味更為濃郁，但也由于其處理條件過于強烈，結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致榨得的山柚油色澤、透明度的得分均相對于未處理組有所下降。經(jīng)過微波預(yù)處理的山柚油，各項指標均相對未處理組有較大提升，是一種優(yōu)秀的山柚油預(yù)處理方法。

2.2 山柚油抗氧化性測定結(jié)果與分析

2.2.1 山柚油對DPPH·自由基清除能力的結(jié)果分析

經(jīng)過不同預(yù)處理的山柚油對DPPH·自由基清除能力對比如圖2所示，山柚油無論是否進行預(yù)處理均有清除DPPH·自由基的能力，而且清除DPPH·自由基的能力與山柚油濃度之間存在明顯的正量效關(guān)系，自由基清除效果隨著濃度的增加而增強。但比較發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過焙炒處理的山柚油DPPH·自由基清除能力在高濃度時更為顯著，而微波處理和烘烤處理則無明顯差異，但經(jīng)過預(yù)處理的山柚油清除自由基能力其他均高于未處理的山柚油。說明無論何種預(yù)處理方式均能提升山柚油清除DPPH·自由基的能力。

圖2 不同預(yù)處理方式的山柚油清除DPPH·自由基能力對比

表2 不同預(yù)處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(DPPH·法)

由表2比較，由于半抑制濃度越低，抗氧化能力越強，因此可以發(fā)現(xiàn)山柚油具有較強的抗氧化能力，且抗氧化效果焙炒處理最好，微波處理略優(yōu)于烘烤處理。但經(jīng)過預(yù)處理的山柚油的抗氧化均明顯優(yōu)于未經(jīng)過預(yù)處理的山柚油。

2.2.2 山柚油對ABTS+·自由基清除能力的結(jié)果分析

由圖3分析可以看出，3種經(jīng)過預(yù)處理的山柚油對ABTS+·自由基清除能力明顯高于未經(jīng)過預(yù)處理的山柚油，且清除ABTS+·自由基能力隨著山柚油濃度升高而變強，兩者之間存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。且預(yù)處理能明顯提升山柚油的抗氧化能力。

經(jīng)過表3數(shù)據(jù)分析比較可知，根據(jù)半抑制濃度越低，樣品抗氧化性越強的原理，經(jīng)過焙炒預(yù)處理的山柚油抗氧化能力最好，經(jīng)烘烤預(yù)處理的次之，經(jīng)過微波預(yù)處理的最弱，但抗氧化能力均高于未處理組，說明山柚油具有良好抗氧化能力，且適當?shù)念A(yù)處理能顯著提高山柚油的抗氧化能力。

圖3 不同預(yù)處理方式的山柚油清除ABTS+·自由基能力對比

表3 不同預(yù)處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(ABTS法)

圖4 不同預(yù)處理方式的山柚油對羥基自由基清除能力對比

2.2.3 山柚油對羥基自由基清除能力的結(jié)果分析

根據(jù)圖4可以發(fā)現(xiàn)，山柚油對羥基自由基清除能力隨濃度加大而升高，且經(jīng)過預(yù)處理的山柚油清除羥基自由基能力明顯好于未經(jīng)過預(yù)處理的山柚油，說明預(yù)處理能明提升山柚油對羥基自由基的清除能力。

根據(jù)表4進行分析，半抑制濃度越低，則抑制效果越強，因此可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過焙炒預(yù)處理的山柚油清除羥基自由基能力最好，其次是烘烤處理，再次是微波處理，未經(jīng)過預(yù)處理的山柚油清除羥基自由基能力最弱，說明適當?shù)念A(yù)處理能提高山柚油對羥基自由基的清除效果。

表4 不同預(yù)處理方式的山柚油的抗氧化活性比較(羥基自由基清除法)

2.3 山柚油對各自由基清除能力的差異性分析

利用SPSS統(tǒng)計軟件，應(yīng)用t檢驗對不同預(yù)處理方式進行顯著性差異分析。

由表5可以看出，經(jīng)過預(yù)處理的山柚油對DPPH的清除效果與未處理(對照組)相比較P值均小于0.01，表明差異非常顯著，且經(jīng)過預(yù)處理的山柚油DPPH自由基清除效果均顯著高于未處理組的山柚油，其中焙炒處理及烘烤處理之間差異不顯著，焙炒處理與微波處理之間差異顯著，烘烤處理與微波處理之間差異不顯著。

由表6可以看出，經(jīng)過預(yù)處理的山柚油對ABTS自由基的清除效果均顯著高于未處理組的山柚油，焙炒處理與烘烤處理得到的ABTS抑制率差異顯著，焙炒處理與微波處理得到的ABTS抑制率差異顯著，烘烤處理與微波處理得到的ABTS抑制率之間差異不顯著，并且經(jīng)過焙炒處理的ABTS自由基清除效果顯著高于烘烤處理和微波處理。

由表7可以看出，經(jīng)過預(yù)處理的山柚油對羥基自由基的清除效果均顯著高于未處理組，烘烤處理與微波處理之間無顯著差異，焙炒處理顯著高于烘烤處理和微波處理的抗氧化性。

由表5～表7可以看出，經(jīng)過預(yù)處理的山柚油的抗氧化性均顯著高于未處理組山柚油的抗氧化性，焙炒處理山柚油的抗氧化性顯著優(yōu)于烘烤及微波處理組山柚油的抗氧化性，烘烤處理及微波處理的山柚油的抗氧化性無明顯差異。

表5 DPPH自由基清除率差異性分析

注：P<0.05時差異顯著，P<0.01時差異極顯著,余同。

表6 ABTS自由基清除率差異性分析

表7 羥基自由基清除率差異性分析

2.4 山柚油抑菌效果實驗結(jié)果與分析

采用牛津杯法，以抑菌圈直徑大小為指標，研究山柚油對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、李斯特菌及黑曲霉的抑制效果。最終僅有沙門氏菌存在直徑大小為22.0 mm的抑菌圈，說明山柚油對沙門氏菌存在抑制效果，且山柚油對沙門氏菌的最低抑菌濃度為 0.62%。山柚油對其他4種菌均沒有表現(xiàn)出抑菌效果。

3 結(jié)論

本研究通過感官評定的方法，并借助定量描述分析法得出合理的預(yù)處理有利于山柚油的感官特性，并最終確定最有利于山柚油感官指標的預(yù)處理方式是微波處理。通過DPPH法、ABTS法及測定羥基自由基清除率3個方法對山柚油的抗氧化特性進行綜合評定，最終發(fā)現(xiàn)進行有效的預(yù)處理均能增強茶油的抗氧化能力，其中焙炒處理效果很好，烘烤處理與微波處理差異不顯著，但均顯著高于未處理的山柚油。通過牛津杯法測定山柚油對大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙門氏菌(Salmonella)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)山柚油僅對沙門氏菌存在顯著的抑制效果。本研究結(jié)果表明適當?shù)念A(yù)處理能明顯提升山柚油的感官特性及抗氧化效果，油茶籽在適當?shù)念A(yù)處理(焙炒、烘烤、微波)過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)產(chǎn)生豐富的風(fēng)味物質(zhì)，提高了山柚油的感官品質(zhì)，且微波預(yù)處理是從綜合角度考量最適合山柚油的預(yù)處理方式。