超聲輔助酶解法提取亞麻籽油的工藝

高瑞苑 尹三毛 李志英 張海容

(忻州師范學(xué)院化學(xué)系，忻州 034000)

亞麻籽俗稱胡麻籽，是亞麻科的一年生或多年生草本植物亞麻的種子，其中含有不飽和脂肪酸，以及蛋白質(zhì)、膳食纖維、維生素、微量元素等多種對人體有益的成分，適用于人體保健[1，2]。亞麻籽中含油率達(dá)35%～48%，亞麻籽油中不飽和脂肪酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)80%以上，并且富含α-亞麻酸、維生素E、類黃酮[2，3]。α-亞麻酸是人體的一種必需脂肪酸，具有豐富的藥理作用[4，5]，在體內(nèi)能轉(zhuǎn)化成DHA，對智力和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育大有裨益。

目前，國內(nèi)外亞麻籽油的提取方法主要有壓榨法、溶劑浸提法、生物酶法、超臨界萃取法等[6，7]。壓榨法分為冷榨和熱榨，壓榨全過程無任何化學(xué)添加劑，但冷榨法出油率低，熱榨相對于冷榨法出油率較高，但油色澤較暗。溶劑浸提法提油率較高，多利用有機(jī)溶劑，溶劑用量較大，增加加工成本[6]。超臨界萃取需要在高壓的條件下進(jìn)行，這對設(shè)備及工藝技術(shù)的要求極高，也使生產(chǎn)成本增加[7]。生物酶法提油是最近油脂工業(yè)的研究熱點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)通過酶解將組織結(jié)構(gòu)和大分子物質(zhì)破壞，再利用超聲波輔助法進(jìn)一步破壞細(xì)胞組織，使細(xì)胞中的游離油流動性增強(qiáng)，從而提高提取率[8]。

本實(shí)驗(yàn)利用纖維素酶和堿性蛋白酶將亞麻籽細(xì)胞壁、多糖及脂蛋白分解，在此基礎(chǔ)上，利用超聲波輔助進(jìn)一步將亞麻籽細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)破壞，使油脂能夠充分的溶出[9]。結(jié)合酶本身的特點(diǎn)及超聲波的使用條件，確定料液比、加酶量、保溫溫度、保溫時間、pH、超聲時間及超聲功率作為單因素考察變量，以亞麻籽油得率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken響應(yīng)面分析法，對影響較大的因素：料液比、加酶量、保溫溫度、pH、超聲時間進(jìn)行分析，確定最佳的提取條件，以期優(yōu)化亞麻籽油提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

亞麻籽：產(chǎn)地為山西省神池縣烈堡鄉(xiāng)；堿性蛋白酶，酶活力 200 U/mg；纖維素酶，酶活力50 U/mg；果膠酶：3 000 000 U/g；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸均為分析純。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

100Y多功能粉碎機(jī)；pHS-3C酸度計(jì)；TDL-40B離心機(jī)；HH-6SH數(shù)顯恒溫水浴鍋；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 超聲酶法提取亞麻籽油的工藝流程

亞麻籽原料→脫膠→烘干→粉碎過篩(60目)→加沸水→調(diào)節(jié)pH→加酶→超聲→保溫浸提→離心分離(4 000 r/min，10 min，取上清液)→萃取(取上層液體)→旋蒸→亞麻籽油。

1.3.2 脫膠處理方法

首先對亞麻籽進(jìn)行脫膠處理[10]，先清理掉亞麻籽中的空殼，碎粒，發(fā)霉的種子，以及石子、雜草等雜質(zhì)。取處理好的亞麻籽500 g置于燒杯中，加入3 g果膠酶，水浴加熱到40 ℃，攪拌均勻，保溫30 min，用紗布過濾，除去亞麻籽表面的膠，再用40 ℃的清水清洗幾次，充分將亞麻籽表面的膠去除。放入干燥箱中60 ℃下烘干，粉碎，得亞麻籽粉末。

1.3.3 亞麻籽油提取及得率計(jì)算方法

取15 g脫膠后的亞麻籽粉末，加入一定量的沸水，攪拌均勻。待料液冷卻后，調(diào)節(jié)至所需pH。加入堿性蛋白酶，水浴保溫十分鐘，再加入纖維素酶，超聲。然后4 000 r/min下離心10 min，取上清液，用正己烷萃取，旋蒸，得亞麻籽油，干燥、稱重。

1.3.4 單因素實(shí)驗(yàn)

考察料液比、加酶量、提取溫度、酶解pH、超聲時間、超聲功率各自對亞麻籽油得率的影響。選取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加酶量0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g，提取溫度30、40、50、60、70 ℃，酶解pH 4、5、6、7、8、9、10、11，超聲時間10、20、30、40 min，超聲功率160、240、320、400 W，進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)，通過計(jì)算亞麻籽油得率，確定響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)范圍，進(jìn)而優(yōu)化提取亞麻籽油的工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 料液比對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入煮沸的蒸餾水，不斷攪拌，待料液冷卻，再加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.15 g，提取溫度40 ℃，超聲時間10 min，超聲功率200 W，條件下提取，得到料液比對亞麻籽油得率的影響如圖1所示。

圖1 料液比、加酶量、提取時間對亞麻籽油得率的影響

由圖1可知，亞麻籽油得率隨料液比的增加而增加，當(dāng)料液比超過1∶10后提油率增長緩慢，可能原因是隨著料液比的增加，酶與亞麻籽原料能夠充分接觸，酶解更加充分，使油脂更易溶出，隨著料液比繼續(xù)增加時，因?yàn)槊附庾饔糜邢?，亞麻籽油得率增加不明顯[11]。故選擇合適的料液比為1∶10。

2.1.2 加酶量對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不斷攪拌，待料液冷卻，分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.05、0.10、0.15、0.20 g，在超聲時間10 min，超聲功率200 W，提取溫度40 ℃，條件下提取，得到加酶量對亞麻籽油得率的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著加酶量的增加，亞麻籽油得率增加，但是在超過0.1 g以后，得率開始下降?？赡茉蚴牵S著加酶量的增加，酶水解細(xì)胞組織的效果增加，使得細(xì)胞中的大分子蛋白質(zhì)、糖類等水解徹底，有利于細(xì)胞內(nèi)油脂的釋放，從而亞麻籽油的得率增加，隨著加酶量的繼續(xù)增加，料液中酶解后產(chǎn)生的小分子成分增加，使得游離的油脂與料液不易分離徹底，從而使得亞麻籽油得率降低[12]。故選擇合適的加酶量為0.10 g。

2.1.3 提取溫度對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不斷攪拌，待料液冷卻，分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.10 g，在超聲時間10 min，超聲功率200 W，提取溫度為30、40、50、60、70 ℃，條件下提取。得到不同提取溫度對亞麻籽油得率的影響如圖1所示。

由圖1可知，隨著溫度的升高亞麻籽油的得率增加，但在超過50 ℃以后，得率開始下降，可能原因是，纖維素酶和堿性蛋白酶的最適溫度45 ℃，在達(dá)到酶活性的最適溫度之前，隨著溫度的升高，酶活性增加，酶解作用增強(qiáng)，亞麻籽油得率增加，但在超過酶活性的最適溫度后，酶的活性開始降低，導(dǎo)致亞麻籽油的得率下降[13]。故選擇合適的提取溫度為50 ℃。

2.1.4 酶解pH對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不斷攪拌，待料液冷卻，調(diào)節(jié)pH為4、5、6、7、8、9、10、11，加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.10 g，在超聲時間10 min，超聲功率200 W，提取溫度50 ℃，條件下提取，得到酶解pH對亞麻籽油得率的影響如圖2所示。

圖2 酶解pH、超聲時間、超聲功率對亞麻籽油得率的影響

由圖2可知，pH由4～6時，纖維素酶發(fā)揮主要作用，隨著pH的升高亞麻籽油的得率增加，這與纖維素酶的活性隨pH變化有關(guān)，pH為6時，纖維素酶活性最大。pH由7～10時，堿性蛋白酶發(fā)揮主要作用，隨著pH的升高亞麻籽油的得率增加，這與堿性蛋白酶的活性隨pH變化有關(guān)，pH為10時，堿性蛋白酶活性最大，pH超過10以后，堿性蛋白酶活性下降，得率下降，pH通過影響酶的活性進(jìn)而影響亞麻籽油的得率[6]。故選擇合適的酶解pH為10。

2.1.5 超聲時間對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不斷攪拌，待料液冷卻，調(diào)pH至10，加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.10 g，在超聲功率200 W、提取溫度50 ℃，改變超聲時間20、30、40、50 min，條件下提取，得到超聲時間對亞麻籽油得率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲時間的升高亞麻籽油的得率增加，但在超過40 min以后，得率開始下降，可能原因是，隨著超聲時間的增加，細(xì)胞組織被破壞的更加充分，有利于酶解的進(jìn)一步作用，使得游離油流動性增強(qiáng)，更易溶出，從而提高了亞麻籽油的得率，隨著超聲時間的繼續(xù)增加，細(xì)胞釋放油脂分子的速度和油脂分子的擴(kuò)散速度達(dá)到動態(tài)平衡，游離油與料液的混合度增加，使得游離油的分離困難，造成部分油脂難以徹底分離，使得亞麻籽油的得率降低[14]。故選擇合適的超聲時間為40 min。

2.1.6 超聲功率對亞麻籽油得率的影響

準(zhǔn)確稱取亞麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不斷攪拌，待料液冷卻，調(diào)節(jié)pH至10，分別加入堿性蛋白酶和纖維素酶各0.10 g，在超聲時間40 min，提取溫度50 ℃，改變超聲功率160、240、320、400 W，條件下提取，得到超聲功率對亞麻籽油得率的影響如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲功率的升高亞麻籽油的得率增加，但在超過240 W以后，得率開始下降，可能原因是，隨著超聲功率的增加，細(xì)胞組織被分解的更加徹底，細(xì)胞組織釋放油脂分子的速度和油脂分子的擴(kuò)散速度不斷增加，當(dāng)達(dá)到一定值后達(dá)到動態(tài)平衡，油脂的產(chǎn)量不再增加，但隨著超聲功率的繼續(xù)增加，亞麻籽細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞更加徹底，亞麻籽顆粒粉末度加大，這就增加了混合油分離的難度和部分油脂的損耗，使得亞麻籽油的得率降低[15]。故選擇合適的超聲功率為240 W。各單因素實(shí)驗(yàn)除超聲功率外，不同條件對亞麻籽油得率的影響范圍在3.11%～12.87%之間，不同超聲功率對亞麻籽油得率的影響范圍為2.43%<3.11%，因此，超聲功率沒有列入響應(yīng)面因素中。

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，采用Design-Expert軟件設(shè)計(jì)五因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。選擇料液比(A)、加酶量(B)、提取溫度(C)、酶解pH(D)、超聲時間(E)為自變量，亞麻籽油得率(Y)為響應(yīng)值。響應(yīng)面因素水平及編碼見表1，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及編碼

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

續(xù)表2

對表2中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到亞麻籽油得率的多元二次回歸方程:Y=30.51+0.63A-0.26B-0.20C+1.07D-0.40E+0.008 833AB-0.52AC+0.84AD-0.23AE-0.81BC+0.20BD+0.14BE+0.060CD-0.22CE+0.46DE-3.65A2-2.38B2-3.59C2-3.43D2-2.39E2?；貧w模型的顯著性檢驗(yàn)及方差分析見表3。由表3可知，模型P<0.000 1，差異極顯著，表明響應(yīng)值與參考變量之間存在極顯著的關(guān)系。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.954 8，說明模型響應(yīng)值的95.48%取決于參考變量，所以該模型擬合度良好。信噪比(Adep Precision=18.288)大于4說明回歸方程的可信度較高。變異系數(shù)等于2.67，說明模型穩(wěn)定性較好。因此，響應(yīng)面法優(yōu)化酶解法提取亞麻籽油工藝可靠、穩(wěn)定性好，得到的回歸方程能較好地預(yù)測實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

表3 回歸模型顯著性檢驗(yàn)及方差分析

注：P<0. 001為差異極顯著水平；0.001

從回歸方程模型因變量的方差分析可知，模型的一次項(xiàng)A、D對響應(yīng)值的影響極顯著，E對響應(yīng)值的影響顯著；交互項(xiàng)影響不顯著；二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2、E2對響應(yīng)值的影響顯著；失擬項(xiàng)P>0.05，差異不顯著。根據(jù)F值大小可知各因素對亞麻籽油得率的影響順序?yàn)镈>A>E>B>C，即酶解pH>料液比>超聲時間>加酶量>提取溫度。

2.2.2 最優(yōu)提取工藝的確定

對多元二次回歸方程求一階偏導(dǎo)，得到在料液比1∶10.5，加酶量0.10 g，提取溫度49.7 ℃，酶解pH 10.2，超聲時間 39 min的條件下，亞麻籽油得率最大為30.53%。結(jié)合實(shí)際的儀器條件，以及實(shí)驗(yàn)具體操作的可行性，修正為料液比1∶10.5，加酶量0.10 g，保溫溫度50 ℃，酶解pH 10，超聲時間 40 min，在修正后的實(shí)驗(yàn)條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，所得亞麻籽油的得率為(30.52±0.04)%，與理論值30.57%接近，實(shí)驗(yàn)值與理論值基本吻合，表明模型誤差小、可靠。

3 結(jié)論

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得到亞麻籽油得率與各因素的二次方程模型為：Y=30.51+0.63A-0.26B-0.20C+1.07D-0.40E+0.008 833AB-0.52AC+0.84AD-0.23AE-0.81BC+0.20BD+0.14BE+0.060CD-0.22CE+0.46DE-3.65A2-2.38B2-3.59C2-3.43D2-2.39E2該模型回歸顯著，對實(shí)驗(yàn)擬合較好，有一定的實(shí)用價值。

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化亞麻籽油的酶解法提取工藝后，得到酶解法提取亞麻籽油的最優(yōu)工藝條件為：料液比 1∶10.5、加酶量 0.10 g、提取溫度 50 ℃、酶解pH 10、超聲時間 40 min，在該條件下所得亞麻籽油的得率為30.52%，所得的油品質(zhì)好，為透明金黃色。

采用超聲輔助酶解法提取亞麻籽油的方法，與傳統(tǒng)壓榨方相比，外觀及穩(wěn)定性方面更好。與溶劑浸提法相比，該方法過程簡單，耗時短。與CO2超臨界萃取相比，該方法設(shè)備簡單，成本低。