超聲提取藜麥β-蛻皮激素的工藝研究

鄭雅瑩 馬挺軍

(北京農(nóng)學院食品科學與工程學院，北京 102206)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)又名昆諾阿藜、南美藜等，為一年生藜科草本植物[1]。藜麥籽粒的營養(yǎng)價值豐富，蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)高達12.5%～16.7%，且必需氨基酸比例均衡，其中富含的組氨酸為嬰幼兒所必需的氨基酸[2]；藜麥中淀粉質(zhì)量分數(shù)為58.1%～64.2%，但其血糖生成指數(shù)較低，適于糖尿病人食用[3]；藜麥籽粒中礦物質(zhì)含量高，Ca和Fe含量高于小麥、玉米等谷物[4]。藜麥中富含具有抗衰老作用的維生素C和維生素E[5]以及不飽和脂肪酸[6]。同時，藜麥籽粒中含有黃酮、皂苷、多酚、γ-氨基丁酸以及蛻皮激素[7-10]等具有生物活性的功能成分。因此藜麥具有降血糖、抗氧化以及抗癌等生理功能[11]。因而被譽為“營養(yǎng)黃金”[12]。

蛻皮激素是一類天然甾體化合物，既存在于昆蟲體內(nèi)為昆蟲換羽激素，又存在于植物中為植物次生代謝產(chǎn)物—植物蛻皮激素，保護植物免受昆蟲和線蟲的侵害[13]。蛻皮激素對哺乳動物和人類具有多種藥理作用，如抗氧化、促進核酸和蛋白質(zhì)的合成、促進糖代謝和脂類代謝、預防骨質(zhì)疏松、促進表皮細胞分化等作用[14，15]。蛻皮激素在植物中的含量遠高于在動物體內(nèi)的含量，且只有少數(shù)食用植物中存在蛻皮激素，包括菠菜、藜科以及薯蕷，其中藜麥中β-蛻皮激素含量為0.184～0.484 mg/g，是菠菜的4～12倍[16-19]。β-蛻皮激素(又稱20-羥基蛻皮激素或蛻皮甾酮，20-hydroxyecdysone)是藜麥中最主要的蛻皮激素，還有一些微量單體，如羅漢松甾酮A、24-epi-羅漢松甾酮A、24(28)-dehydro-蛻皮甾酮A等[20]，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示。

β-蛻皮激素的提取方法有超聲法、溶劑回流提取法和浸提法[21]。李紅舟[22]研究超聲法對露水草β-蛻皮激素的提取工藝，優(yōu)化料液比、提取液體積分數(shù)、提取時間以及提取溫度，得到β-蛻皮激素得率為1.9%；徐慧[23]研究藍耳草β-蛻皮激素的提取工藝，通過對比超聲提取和回流提取法，得到β-蛻皮激素得率分別為0.034%和0.041%。Graf等[24]采用浸提法提取藜麥β-蛻皮激素，在80 ℃下，用70%乙醇提取4 h，β-蛻皮激素的得率為0.031%。超聲提取法較浸提法和溶劑回流提取法具有處理時間短、提取溫度低等優(yōu)勢，且對甾體類化合物的提取效果較好，適合β-蛻皮激素的提取。

本實驗以藜麥為原料，采用響應面法優(yōu)化超聲提取β-蛻皮激素的工藝條件，利用高效液相色譜法測定β-蛻皮激素含量，同時測定其體外抗氧化活性，為藜麥蛻皮激素類物質(zhì)的進一步研究與開發(fā)利用提供參考。

圖1 藜麥中主要蛻皮激素化合物的結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“冀藜1號”藜麥：河北張家口農(nóng)業(yè)科學院；β-蛻皮激素標準品、ABTS、甲醇(色譜純)、超純水、無水乙醇(分析純)、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉；維生素C 。

1.2 儀器與設備

KQ-700E型超聲波清洗器；常規(guī)冷凝裝置；SH B-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵；TDZ5M型臺式低速離心機；DH-101型電熱恒溫鼓風干燥箱；德爾高速粉碎機；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-2000；Shimadzu LC-20AD液相色譜。

1.3 方法

1.3.1 藜麥β-蛻皮激素的提取及其含量測定

準確稱取藜麥粉1.0 g，按一定液料比加入乙醇溶液，30 ℃下于700 W、40 kHz下超聲，4 000 r/min離心10 min，取上清液，旋蒸至干，加入甲醇重溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

色譜條件：色譜柱：TC-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇：水=40：60(V/V，%)；流速：0.8 mL/min；檢測波長：246 nm；柱溫:31 ℃；進樣量：10 μL。

1.3.2 β-蛻皮激素標準曲線的繪制

準確配制0.005、0.01、0.02、0.04、0.08 mg/mL的β-蛻皮激素標準溶液，根據(jù)色譜圖中峰面積計算β-蛻皮激素含量，實驗重復3次，計算平均值，以色譜圖中峰面積為縱坐標y，以待測樣品質(zhì)量濃度為橫坐標x繪制標準曲線，如圖2所示?；貧w方程為y=2×107x+9075.5(R2=0.999 7)，數(shù)據(jù)顯示曲線擬合性良好。

圖2 β-蛻皮激素標準曲線

1.3.3 單因素實驗

1.3.3.1 乙醇體積分數(shù)的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，分別加入50%、60%、70%、80%、90%乙醇水溶液10 mL，在30 ℃下超聲提取30 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.3.2 超聲時間的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，加入60%乙醇水溶液10 mL，在30 ℃下分別超聲提取10、20、30、40、50 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.3.3 液料比的選擇

精確稱取藜麥粉1.0 g于50 mL離心管中，分別按照2∶1、6∶1、10∶1、14∶1、18∶1(mg/L)的液料比加入60%乙醇水溶液，在30 ℃下超聲提取30 min，離心取上清液，旋蒸至干，加入甲醇5 mL重溶，過0.22 μm有機濾膜，待測。

1.3.4 Box-Behnken響應面優(yōu)化設計

根據(jù)Box-Behnken實驗設計原理進行三因素三水平實驗設計，采用Design-Expert 8.0.6軟件進行數(shù)據(jù)擬合，優(yōu)化藜麥中β-蛻皮激素含量的工藝條件。在單因素實驗的基礎上，選擇乙醇體積分數(shù)(A)、超聲提取時間(B)、液料比(C)作為響應面優(yōu)化的實驗點，分別以-1、0、1對自變量的實驗水平編碼，共有17組實驗，其中12組為析因點；5組為區(qū)域的中心零點。實驗因素和水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗設計因素和水平

1.3.5 藜麥β-蛻皮激素體外抗氧化實驗—ABTS自由基清除實驗

根據(jù)宋思圓[25]的方法改進，過硫酸鉀與ABTS溶液混合，室溫避光反應12～16 h，制備得到ABTS儲備液。用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)稀釋ABTS儲備液，直至在734 nm的吸光度為0.70±0.02。取4 mL ABTS測定液，加入40 μL樣品待測液，振蕩30 s，避光反應30 min后測定734 nm處的吸光度值，平行測定3次，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分數(shù)對藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

由圖3可知，藜麥中β-蛻皮激素提取量隨著乙醇體積分數(shù)的升高，呈先上升后下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)達到60%時，藜麥中β-蛻皮激素的提取效果相對較好，為0.358 7 mg/g。而當乙醇體積分數(shù)超過60%時，β-蛻皮激素的提取量逐漸下降。根據(jù)相似相溶原理，β-蛻皮激素為弱極性物質(zhì)，易溶于乙醇，而其結(jié)構(gòu)中含有6個羥基，能溶于水。因此得到乙醇體積分數(shù)為60%時，β-蛻皮激素提取量最大。

2.1.2 超聲時間對藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

如圖3所示，超聲時間在10～30 min內(nèi)，隨著超聲時間的延長，β-蛻皮激素質(zhì)量濃度呈上升趨勢，達到30 min時β-蛻皮激素提取量最高，為0.324 6 mg/g。當超聲時間大于30 min時，β-蛻皮激素提取量呈先下降后上升的趨勢。這可能是超聲時間過長導致β-蛻皮激素發(fā)生分子重排，使其在40 min時提取量降低；當超聲時間延長至50 min時，在超聲處理的作用下，β-蛻皮激素分子中負責分子重排的結(jié)構(gòu)單元合成β-蛻皮激素類似物，使其提取量增加，但并未超過峰值[26]。因此，超聲時間選擇30 min左右。

2.1.3 料液比對藜麥中β-蛻皮激素含量的影響

如圖3所示，乙醇體積分數(shù)為60%、超聲時間為30 min時，液料比在2∶1～14∶1范圍內(nèi)，β-蛻皮激素提取量呈逐漸上升的趨勢，當液料比達到14∶1時，β-蛻皮激素含量為0.376 6 mg/g。當液料比大于14∶1時，β-蛻皮激素提取量趨于平緩。這表明液料比繼續(xù)增大時，對β-蛻皮激素質(zhì)量濃度影響不顯著。因此，將液料比確定為14∶1。

圖3 超聲時間、乙醇體積分數(shù)、液料比對藜麥β-蛻皮激素含量的影響

2.2 響應面實驗結(jié)果

2.2.1 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果分析

綜合單因素實驗結(jié)果，以藜麥β-蛻皮激素質(zhì)量濃度為響應值，考察乙醇體積分數(shù)(A)、超聲時間(B)、液料比(C)三個因素對其影響，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken設計三因素三水平實驗，實驗設計方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立及顯著性檢驗結(jié)果

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行響應面回歸分析，建立藜麥β-蛻皮激素含量(Y)的回歸模型，擬合二次多項式方程：

Y=0.38-0.017A+0.012B+4.013×10-3C-4.975×10-3AB+0.016AC-4.075×10-3BC-0.051A2-0.048B2-0.034C2

表2 響應面設計方案及實驗結(jié)果

Y=0.38-0.017A+0.012B+0.016AC-0.051A2-0.048B2-0.034C2

表3 回歸模型顯著性檢驗結(jié)果

注：**差異極顯著(P<0.01)；*差異顯著(P<0.05)。

2.2.3 響應面分析

由圖4a可知，在液料比為14∶1的條件下，乙醇體積分數(shù)與超聲時間的交互作用較弱。當固定乙醇體積分數(shù)時，隨著超聲時間的延長，藜麥中β-蛻皮激素含量增大，但達到峰值后又呈下降趨勢。圖4b顯示，在超聲時間為30 min條件下，乙醇體積分數(shù)與液料比交互作用顯著，在液料比較小時，β-蛻皮激素含量隨乙醇體積分數(shù)的增加而增加，達到峰值逐漸下降。由圖4c可知，在乙醇體積分數(shù)為60%時，超聲時間和液料比的交互作用較弱。說明超聲時間對β-蛻皮激素含量產(chǎn)生的影響與液料比的關系較小。

圖4 各因素交互作用對β-蛻皮激素含量影響的響應面圖

通過Design-Expert 8.0.6軟件，并結(jié)合回歸模型和響應面圖分析得出提取藜麥β-蛻皮激素最佳條件為：乙醇體積分數(shù)58.25%、超聲時間31.12 min、液料比14.37∶1。在此條件下，預測藜麥中β-蛻皮激素含量為0.382 4 mg/g。綜合考慮實際情況，將工藝條件調(diào)整為乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間30 min、液料比14∶1，在此條件下重復3次，測得β-蛻皮激素含量的平均值為0.379 1 mg/g，與模型預測值基本相符，證明此模型有效可靠。最終優(yōu)化的藜麥β-蛻皮激素的提取條件為乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間30 min、料液比14∶1，得到β-蛻皮激素含量為0.379 1 mg/g。

2.3 體外抗氧化活性測定結(jié)果

由圖5可知，當β-蛻皮激素質(zhì)量濃度為0～5 μg/mL時，對ABTS+·清除能力隨β-蛻皮激素質(zhì)量濃度的增加而提高，5 μg/mL β-蛻皮激素對ABTS+·的清除率為63.8%；當β-蛻皮激素質(zhì)量濃度高于5 μg/mL時，其對ABTS+·的清除效果沒有顯著差異，抗氧化性強于VC。此外，可以得到β-蛻皮激素清除ABTS+·的IC50值為3.92 μg/mL。這可能由于β-蛻皮激素中具有多個羥基，可以與ABTS+·配對，從而使綠色的ABTS+·溶液褪色，反映其抗氧化能力[27]。Nsimba R Y等[28]采用DPPH自由基清除法和FRAP法對藜麥蛻皮激素抗氧化活性進行測定，得到β-蛻皮激素清除DPPH自由基的IC50值為3.8 μg/mL以及FRAP法測得的IC50為34.5 μg/mL，可以得出β-蛻皮激素具有一定的抗氧化活性，與本研究結(jié)果一致。但β-蛻皮激素對ABTS+·的清除作用機理有待進一步的研究。

圖5 藜麥β-蛻皮激素對ABTS+·的清除作用

4 結(jié)論

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法，以β-蛻皮激素含量為響應值，對提取藜麥中β-蛻皮激素的工藝條件進行優(yōu)化，最佳的提取工藝條件為乙醇體積分數(shù)60%、超聲時間30 min、液料比14∶1，在此條件下藜麥β-蛻皮激素含量為0.379 1 mg/mL。體外抗氧化實驗表明：5 μg/mL的β-蛻皮激素對ABTS+·的清除率為63.8%，IC50值為3.92 μg/mL，說明β-蛻皮激素具有一定的抗氧化活性。本研究獲得了一種簡單的β-蛻皮激素提取工藝，可為后續(xù)開發(fā)β-蛻皮激素相關產(chǎn)品提供參考。