日本無刺花椒抗寒性的初步研究

陳 政，李佩洪，唐 偉，龔 霞，吳銀明，吳 軍

（四川省植物工程研究院，四川資中 641200）

花椒（Zanthoxylum bungeanum Maxim）原產(chǎn)于我國中西部，為蕓香科花椒屬落葉灌木或小喬木。全世界約有花椒屬植物250 種，分布于亞洲、非洲、大洋洲、北美洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]。中國是世界花椒第一生產(chǎn)大國，有39 種14 變種[2]。四川是我國花椒主產(chǎn)區(qū)之一，漢源花椒、茂縣大紅袍花椒、金陽青花椒、洪雅藤椒、蓬溪青花椒是四川花椒中的五朵金花，是全國優(yōu)質(zhì)花椒之一。由于花椒樹干、枝、葉具刺，在育苗、栽植、管理和采收等方面有諸多不便，尤其采收難度大、成本高，花椒采收難是花椒生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題，若能以無刺或少刺花椒品種替代有刺花椒，將會(huì)大幅度提高采收效率、節(jié)約采收成本。為解決生產(chǎn)中花椒刺多的問題，我院于2009 年從河北林業(yè)科學(xué)研究院引進(jìn)花山椒、朝倉山椒、葡萄山椒和琉錦山椒等無刺花椒品種進(jìn)行引種栽培試驗(yàn)。日本無刺花椒（Zanthoxylum Japonica），為落葉小灌木，雌雄異株，無刺或少刺。樹勢直立，萌芽力和成枝力均強(qiáng)。雌花具有雌蕊1～3 枚；雄花具有雄蕊5～6 枚，花粉量大。果實(shí)圓形或橢圓形，油腺點(diǎn)小且密，果皮鮮紅色[3]。果皮、青果、嫩芽、種子等均有重要的應(yīng)用價(jià)值。日本無刺花椒由于無刺或少刺，采摘和管理方便，較“茂汶花椒”“漢源花椒”“九葉青花椒”“藤椒”等花椒品種節(jié)約大量采摘用工和管理用工。日本無刺花椒在引種、育苗、栽培機(jī)理、修剪技術(shù)、施肥技術(shù)、風(fēng)味物質(zhì)及離體愈傷組織等方面做了大量工作[4-12]，但對(duì)無刺花椒抗寒性研究報(bào)道較少，畢君[8]對(duì)1a 生枝條的細(xì)胞膜透性和SOD 活性變化、POD 活性變化、MDA含量變化、自然越冬的枝條電導(dǎo)率與凍害3 種途徑進(jìn)行抗寒評(píng)價(jià)，而紅花椒抗寒性研究報(bào)道較多[13-17]。為此，筆者對(duì)無刺花椒材料的抗寒性進(jìn)行初步研究?；ń房购匝芯颗c農(nóng)業(yè)生產(chǎn)密切相關(guān)。解決花椒寒害的途徑很多，其中選用耐寒的優(yōu)良花椒品種是最經(jīng)濟(jì)、也是最有效的途徑之一。因此，探索花椒抗寒性生理機(jī)制，不僅在理論上有重要意義，而且在生產(chǎn)中也具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在四川省資中縣明心寺鎮(zhèn)，位于29°44.29′N，104°56.38′E，年均氣溫17.4℃，極端最低氣溫-3.2℃，極端最高氣溫41.9℃，年均日照時(shí)數(shù)1246.5h，年均降雨量1007.7mm，降雨量主要分布在5～9 月。土壤為砂壤土，pH 值7.0，海拔310m。

1.2 試驗(yàn)材料

測定的材料有朝倉山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒，共4 個(gè)品種，樹齡為2a。

1.2.1 朝倉山椒。枝條密集，成抱頭狀生長，新梢上部綠色下部為棕色；樹皮光滑，基本無刺；葉片長寬均值為20.66mm/9.62mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為11～15 枚；果實(shí)圓形，果實(shí)縱橫徑均值為4.85mm/4.46mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色[18]。油腺點(diǎn)小、密而深陷。花期為3 月中下旬，果期為8 月中下旬。

1.2.2 葡萄山椒。枝條較疏張，生長勢較弱；有皮刺；新梢上部綠色，下部為棕色；葉片長寬均值為24.66mm/12.28mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為9～17 枚；果實(shí)較大，果實(shí)縱橫徑均值為6.45mm/5.07mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色[18]。油腺點(diǎn)小且密而深陷，花期為3 月中下旬，果期為8 月中下旬。

1.2.3 琉璟山椒。樹姿較舒張，生長勢較強(qiáng)；無刺；新梢上部綠色，下部為棕色；葉片長寬均值為21.27mm/10.17mm，葉緣為鋸齒狀，葉片平整，小葉數(shù)多9～15 枚；果實(shí)較大，圓形，縱橫徑均值為5.94mm/5.01mm，臍部有一小突起，有殘留花柱，果皮鮮紅色[18]。油腺點(diǎn)小、密而深陷?；ㄆ? 月中下旬，果期為8 月下旬～9 月上旬。

1.2.4 花山椒。樹勢強(qiáng)，枝條粗壯；無刺；葉片長寬均值為25.67mm/12.26mm，葉緣為鋸齒狀，向內(nèi)卷曲，小葉數(shù)多為13～15 枚；成花容易且花粉量極大，是比較理想的授粉品種[18]。花期為3 月上中旬。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物材料處理。2019 年4 月，取樣時(shí)間為上午7：00～9：00，剪取健康、無病蟲害的朝倉山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒花椒幼樹樹冠中部外側(cè)的4 個(gè)方位的夏梢頂部向下的第4 葉、第5 葉（完整葉），將葉片用潔凈的濕紗布擦拭并晾干，按品種、處理分裝于塑料袋中，放入冰箱內(nèi)進(jìn)行人工冷凍，處理溫度分別為-6、-4、-2、0、2 和4℃并保持恒溫5h。隨后，將各處理葉片放入-20℃超低溫冰箱中保存，用于測定SOD 活性、POD 活性、MDA 含量生理指標(biāo)，設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

2019 年1 月上旬在資中試驗(yàn)地內(nèi)，選取朝倉山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒4 種花椒的健康、無病蟲害的1a 生枝條作為供試材料。將各花椒的枝條用潔凈的濕紗布擦拭并晾干，放入冰箱內(nèi)從0℃開始降溫，降溫速率為4℃/h，處理溫度分別為：-4、-8、-12、-16、-20、-24、-28℃，并保持恒溫12h。再以同樣的速率升溫至0℃，取出枝條用于REC 的測定，以放置室溫下（約為0℃）的枝條為對(duì)照（CK），設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.3.2 指標(biāo)測定方法。過氧化物酶（POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用NBT（氮藍(lán)四唑）光化還原法，丙二醛（MDA）含量測定采用硫代巴比妥酸法，電解質(zhì)外滲率采用電導(dǎo)率法。數(shù)據(jù)取各生理指標(biāo)3 次測定結(jié)果的平均值。以上測定方法均參考文獻(xiàn)[19]。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)處理用EXCEL 和DPS（v6.85 版）軟件完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SOD 酶活性的變化

在正常條件下，植物細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與消除處于平衡狀態(tài)，這樣可以保持細(xì)胞膜系統(tǒng)的穩(wěn)定性，維持正常的生理代謝活動(dòng)。當(dāng)植物處于各種逆境脅迫時(shí)，這種平衡會(huì)受到破壞而出現(xiàn)自由基的累積，從而引發(fā)或加劇細(xì)胞膜脂過氧化作用，造成膜系統(tǒng)受損，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。在低溫逆境條件下，SOD 能被活性氧誘導(dǎo)產(chǎn)生，從而減輕對(duì)細(xì)胞膜的傷害[20]。SOD、POD 是植物體內(nèi)清除自由基的主要酶類，其活性大小反映細(xì)胞對(duì)逆境的適應(yīng)能力，也間接表明植物耐寒性的強(qiáng)弱。

圖1 降溫處理過程中的SOD 活性變化（單位：u·gFW-1·h-1）

植物在低溫脅迫初期，在植物細(xì)胞內(nèi)，SOD 主要起清除超氧自由基的作用。圖1 所示，各花椒SOD 活性隨著低溫脅迫的加強(qiáng)顯示出了先下降后增加的變化趨勢。隨著低溫的加深，4 個(gè)山椒品系都是從4℃降到0℃時(shí)SOD 活性下降，從0℃降到-6℃時(shí)上升，SOD 活性變化呈“V”趨勢。SOD 活性上升速率并不均勻，在0℃降到-2℃時(shí)SOD 活性上升較快，其中葡萄山椒SOD 活性上升最快，琉錦山椒次之，朝倉山椒SOD 活性上升最慢?；ㄉ浇稴OD 活性的變化趨勢不同，花山椒4℃降到-2℃時(shí)SOD 活性下降，從-2℃降到-6℃時(shí)呈現(xiàn)上升趨勢，活性變化呈“V”趨勢?？梢?，從SOD 活性上升速率來看，葡萄山椒的上升速率最快，琉錦山椒的較快，朝倉山椒的次之，花山椒的最慢。

2.2 POD 酶活性的變化

過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)普遍存在的活性較高的一種酶，它能夠清除超氧自由基形成H2O2[20]，從而保護(hù)植物免受活性氧傷害。圖2 所示，4 個(gè)山椒品系POD 活性隨著低溫脅迫的加強(qiáng)顯示出了花山椒先下降后增加后又下降再增加的變化趨勢。隨著低溫的加深，都是從4℃降到2℃時(shí)POD 活性下降，從2℃降到0℃時(shí)上升，0℃降到-2℃時(shí)呈現(xiàn)下降趨勢，從-2℃降到-6℃時(shí)又呈現(xiàn)上升趨勢，活性變化呈“W”趨勢。朝倉山椒、琉錦山椒和葡萄山椒從4℃降到-2℃時(shí)下降，從-2℃降到-6℃時(shí)上升，活性變化呈“V”趨勢，POD活性上升速率不均勻，4 個(gè)山椒品系在-2℃降到-4℃時(shí)上升較慢，在-4℃降到-6℃時(shí)上升較快，葡萄山椒POD 活性上升速率最快?？梢?，從POD活性上升速率來看，葡萄山椒的最快，花山椒的較快，朝倉山椒的次之，琉錦山椒的最慢。

圖2 降溫處理過程中的POD 活性變化（單位：△OD470·gFW-1·min-1）

2.3 MDA 酶含量的變化

圖3 降溫處理過程中的MDA 含量變化（單位：μmol/g.FW）

植物在逆境條件下往往發(fā)生膜脂過氧化作用，其產(chǎn)物MDA 會(huì)嚴(yán)重?fù)p傷生物膜。通常利用它作為膜脂過氧化指標(biāo)，表示細(xì)胞膜脂過氧化程度及對(duì)逆境反映的強(qiáng)弱，因此在研究植物寒害及抗寒性時(shí)，測定MDA含量的變化可作為一項(xiàng)生理鑒定指標(biāo)[21]。從圖3可知，4 個(gè)山椒品系MDA含量隨著低溫脅迫的加強(qiáng)大多顯示出先下降后上升的趨勢。各山椒品系MDA含量上升溫度不同，增幅也不同?；ㄉ浇稭DA 含量從2℃開始上升，2℃降到0℃時(shí)其MDA 含量上升了0.926μmol/g.FW，隨后增幅變緩；葡萄山椒MDA 含量從0℃開始上升，0℃降到-2℃時(shí)其MDA 含量上升了0.504umol/g.FW，-2℃到-4℃時(shí)MDA 含量上升了1.162umol/g.FW，隨后增幅變緩；琉錦山椒MDA 含量從-2℃開始上升，-2℃降到-4℃時(shí)其MDA 含量上升了1.843umol/g.FW，-4℃降到-6℃時(shí)其MDA 含量上升了0.754umol/g.FW；朝倉山椒MDA 含量從-4℃開始上升，-4℃降到-6℃時(shí)其MDA 含量上升了1.090umol/g.FW。可見，琉錦山椒MDA 含量增幅最大，葡萄山椒的次之，朝倉山椒的再次之，花山椒的最小。

2.4 不同低溫處理對(duì)花椒枝條質(zhì)膜透性的影響

朝倉山椒、葡萄山椒、琉錦山椒、花山椒4 個(gè)山椒品系1a 生枝條經(jīng)低溫處理后，其REC 如圖4所 示。從圖4 可以看出，在一系列冷凍低溫處理下，4種花椒的REC 與處理溫度之間關(guān)系呈上升的“S”形曲線。但其REC 增加的速率并不均勻，處理溫度越低REC 變化相對(duì)越快，且因種類而異。當(dāng)溫度高于-16℃時(shí)，隨溫度降低，枝條的相對(duì)電導(dǎo)率緩慢上升，-16～-24℃期間，相對(duì)電導(dǎo)率急劇增加，之后趨向平緩。-16℃下降至-20℃時(shí)，4 個(gè)山椒品系相對(duì)電導(dǎo)率變化為：琉錦山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅最大，為19.2%；花山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅次之，為15.5%；葡萄山椒的為14.3%；朝倉山椒的相對(duì)電導(dǎo)率增幅最小，僅為7.9%。相對(duì)電導(dǎo)率急劇增大，說明枝條組織已經(jīng)受到嚴(yán)重傷害，膜透性增加，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)大量外滲。由此可知，在相同低溫下，琉錦山椒電解質(zhì)外滲最多，脂膜損傷程度最重；葡萄山椒與花山椒電解質(zhì)外滲較少，朝倉山椒電解質(zhì)外滲最少，脂膜損傷程度較輕，這表明不同花椒種類的抗寒性存在差別。

圖4 不同低溫處理對(duì)日本花椒枝條電解質(zhì)外滲率的影響（單位：%）

3 結(jié)論與討論

（1）正常情況下，細(xì)胞內(nèi)活性氧與防御系統(tǒng)之間保持著平衡。當(dāng)遭遇低溫時(shí)，活性氧代謝失調(diào)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧就會(huì)積聚，從而對(duì)細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)與功能起破壞作用，這時(shí)細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)被誘導(dǎo)和激活，以消除活性氧對(duì)細(xì)胞的損害。試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著溫度的下降，SOD 和POD 和活性呈先下降后升高的變化趨勢，這與劉玲等[22]在花椒的研究結(jié)果一致，與畢君在山椒的研究結(jié)果存在一定差異，這可能是低溫處理方法不同所致。SOD 和POD 活性升高，這是4 個(gè)山椒枝條對(duì)低溫脅迫所產(chǎn)生的保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)。

（2）丙二醛含量與植物抗寒性密切相關(guān)，其含量變化可反映植物對(duì)低溫條件反應(yīng)的強(qiáng)弱，抗寒性強(qiáng)的品系枝條含量增幅較小，而抗寒性弱的品系枝條含量增幅較大。本試驗(yàn)中，琉錦山椒MDA 含量增幅最大，葡萄山椒的次之，朝倉山椒的再次之，花山椒的最小。說明琉錦山椒的抗寒性最弱，葡萄山椒的抗寒性較弱，朝倉山椒和花山椒的抗寒性較強(qiáng)。

（3）植物遭受低溫脅迫，生物膜的結(jié)構(gòu)受到破壞，膜透性增大，從而引起電解質(zhì)外滲，導(dǎo)致相對(duì)電導(dǎo)率的增大。因此，相對(duì)電導(dǎo)率大小能反映細(xì)胞質(zhì)膜的損傷程度。細(xì)胞質(zhì)膜透性大小與植物的抗寒性密切相關(guān)，同樣低溫條件下，細(xì)胞質(zhì)膜透性大，電導(dǎo)率高且上升速度快，表明該植物品種抗寒性差，反之，則抗寒能力強(qiáng)。本試驗(yàn)中，當(dāng)處理溫度降低到-16℃，枝條的相對(duì)電導(dǎo)率出現(xiàn)了一個(gè)快速上升階段，表明枝條受到了嚴(yán)重傷害，細(xì)胞膜透性發(fā)生了不可逆的變化。在-16℃降到-20℃時(shí)，琉錦山椒電解質(zhì)外滲最多，脂膜損傷程度最重；葡萄山椒與花山椒電解質(zhì)外滲較少，朝倉山椒電解質(zhì)外滲最少。結(jié)果表明：朝倉山椒和花山椒抗寒性較強(qiáng)，葡萄山椒次之，琉錦山椒最弱。測定的4 個(gè)無刺花椒與畢君[28]的研究結(jié)果存在一定差異，這可能是低溫處理方法不同所致。