乙型肝炎病毒重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增閉管可視化檢測(cè)方法及裝置

陳 杉，馬雪萍，謝春梅，鄒秉杰，齊謝敏，周國(guó)華

0 引 言

血清病原學(xué)檢查是臨床普遍使用的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)檢測(cè)方法之一，但由于該方法存在檢測(cè)窗口期長(zhǎng)及靈敏度低等限制因素易造成漏檢[1-2]。基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)的HBV核酸檢測(cè)彌補(bǔ)了血清學(xué)檢查的不足，極大縮短了檢測(cè)窗口期，提高了HBV篩查的準(zhǔn)確性[3-4]。然而，PCR技術(shù)需要依賴精密的升降溫設(shè)備，使其難以在資源匱乏的地區(qū)推廣使用。

近年來(lái)興起的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)克服了對(duì)快速升降溫設(shè)備的依賴，僅需在恒定的溫度下即可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶標(biāo)核酸的高靈敏擴(kuò)增檢測(cè)，非常適合于建立病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方法[5-6]。其中，重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)可在37～42 ℃恒溫條件下30 min內(nèi)完成高靈敏的核酸擴(kuò)增[7]，比其他恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法更有優(yōu)勢(shì)。

RPA技術(shù)通過(guò)重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶的協(xié)同作用完成雙鏈DNA模板的指數(shù)擴(kuò)增[8]。在輔助因子T4 UvsY的協(xié)助下，重組酶T4 UvsX與引物結(jié)合形成核酸-蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物在雙鏈DNA中搜尋同源序列，一旦找到就會(huì)入侵雙鏈DNA從而引發(fā)鏈置換反應(yīng)，被置換下來(lái)的互補(bǔ)鏈與單鏈結(jié)合蛋白結(jié)合保持單鏈狀態(tài)。隨后，重組酶從核酸-蛋白復(fù)合物中脫離，隨即與新的引物結(jié)合去開啟新的鏈置換反應(yīng)，同時(shí)DNA聚合酶(Bsu)從引物末端3＇OH開始合成延伸，使兩條親本鏈繼續(xù)分離，結(jié)合正向和反向引物可同時(shí)在兩個(gè)方向合成子鏈DNA，不斷循環(huán)最終實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的指數(shù)積累。雖然RPA的擴(kuò)增速度快、靈敏度高、反應(yīng)條件溫和，非常適合于核酸現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，但如何實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確檢測(cè)是RPA技術(shù)走向現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)所面臨的挑戰(zhàn)。

傳統(tǒng)的凝膠電泳方法雖然能實(shí)現(xiàn)對(duì)RPA產(chǎn)物的檢測(cè)，但操作繁瑣、開管操作易產(chǎn)生交叉污染，不適于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[8]。Exo熒光探針?lè)ㄊ悄壳癛PA產(chǎn)物檢測(cè)最常用的方法，它是在RPA體系中加入exo核酸外切酶III和exo探針, 利用探針特異性識(shí)別擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)而引發(fā)外切酶切割探針產(chǎn)生熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)RPA擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)生類似于熒光定量PCR中的熒光擴(kuò)增曲線，實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)靶標(biāo)的高特異檢測(cè)[9-10]。然而，該方法依然需要昂貴的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀器，增加了檢測(cè)成本。雖然采用側(cè)流層析試紙條技術(shù)可對(duì)RPA產(chǎn)物進(jìn)行可視化檢測(cè)[11-12]，但開管操作易產(chǎn)生交叉污染，盡管利用一次性卡套裝置可實(shí)現(xiàn)在封閉的腔體內(nèi)完成試紙條檢測(cè)過(guò)程，降低了交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，但每管RPA產(chǎn)物均需額外的卡套裝置無(wú)疑增加了耗材成本。因此，開發(fā)一種簡(jiǎn)便的閉管可視化RPA檢測(cè)方法會(huì)更有利于RPA技術(shù)應(yīng)用于病原體現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。

本研究設(shè)計(jì)了一種RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置，RPA反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管放入該裝置中，通過(guò)手機(jī)拍照即可實(shí)現(xiàn)肉眼可視化判讀檢測(cè)結(jié)果。以HBV為檢測(cè)對(duì)象，根據(jù)HBV S基因特異保守序列設(shè)計(jì)RPA引物及exo探針[13-14]，采用實(shí)時(shí)熒光RPA方法優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了高效擴(kuò)增HBV靶標(biāo)的實(shí)時(shí)RPA擴(kuò)增檢測(cè)體系，并利用研制的RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置，實(shí)現(xiàn)了30 min內(nèi)可視化檢測(cè)HBV病毒DNA，為HBV核酸快速檢測(cè)提供了新方法，也為開發(fā)基于RPA的血液HBV現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)篩查平臺(tái)提供了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 引物、探針與質(zhì)粒 根據(jù)HBV編碼S基因特異保守序列分別設(shè)計(jì)6條RPA上下游引物及1條探針，由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。HBV(GenBank 登錄號(hào):NC_003977)、HCV(GenBank 登錄號(hào):NC_004102)、HIV(GenBank 登錄號(hào):NC_001802)、TP(GenBank 登錄號(hào):NC_010741)、H1N1(GenBank 登錄號(hào):NC_026433.1)、H5N1(GenBank 登錄號(hào):AF509026.2)和HPV16(GenBank 登錄號(hào):NC_001526.4)核酸序列的質(zhì)粒均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.2 樣本 為了驗(yàn)證方法的臨床檢測(cè)可行性，收集了20份東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床HBV檢測(cè)剩余的廢棄血清樣本用于檢測(cè)。

1.1.3 儀器及試劑 血清病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自西安天隆科技有限公司；RPA反應(yīng)試劑盒TwistAmp Liquid exo kit購(gòu)自英國(guó)TwistDx公司；德國(guó)Qiagen 公司Rotor-Gene Q儀器用于等溫孵育和實(shí)時(shí)熒光信號(hào)采集。

1.2 方法

1.2.1 RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置的設(shè)計(jì) 便攜式RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置為一小體積暗盒(長(zhǎng)、寬、高分別為112、90、100 mm)，盒內(nèi)設(shè)置有兩個(gè)包含(470±20) nm濾光片的LED激發(fā)光源，暗盒頂部設(shè)計(jì)有一個(gè)帶有(520±10) nm濾光片的信號(hào)采集窗口，將RPA擴(kuò)增30 min后的反應(yīng)管放置在暗盒底部，用手機(jī)在信號(hào)采集窗口拍攝反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)RPA檢測(cè)結(jié)果的肉眼可視化判讀，并可通過(guò)熒光灰度值(ImageJ軟件分析)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析。整個(gè)裝置由鋰電池充電寶供電，便于現(xiàn)場(chǎng)使用。見圖1。

圖1 RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置示意圖

Figure 1 Schematic diagram of RPA product visualized detection device

1.2.2 RPA擴(kuò)增體系的配制 在200 μL反應(yīng)管中配制反應(yīng)混合液，其中每個(gè)RPA反應(yīng)體系為：10 μL 2×Reaction Buffer(試劑盒提供)；1.8 mmol/L dNTPs; 2 μL 10×Probe E-mix(試劑盒提供)；各0.84 μL上下游引物(10 μmol / L); 0.24 μL 探針(10 μmol / L)，渦旋混勻，加入1 μL 20×Core Reaction Mix(試劑盒提供)，顛倒混勻后，再加入0.4 μL 50×Exo(試劑盒提供)，顛倒混勻，最后將1 μL醋酸鎂(280 mmol/L，試劑盒提供)和1 μL模板加到管蓋上不同位置后，離心顛倒混勻。將配制好的反應(yīng)管放入qPCR儀器中39 ℃恒溫反應(yīng)30 min，每30 s讀取熒光信號(hào)1次。

1.2.3 RPA引物的篩選 針對(duì)HBV靶標(biāo)分別設(shè)計(jì)了各3條上下游引物和一條探針(HBV-F1:GTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGCACC；HBV-F2:CGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGAGC；HBV-F3:CTCGTGGTGGACTTCTCTCAATTTTCTAGGGGGA；HBV-R1:AGCAGCAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCC； HBV-R2:CAGGATGAAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAG；HBV-R3：AAGAGGAATATGATAAAACGCCGCAGACACATCC；HBV-probe：TGTCCTGGCCAAAATTCGCAGTCCCCAACC[T(FAM)]CC[THF]A[T(BHQ1)]CACTCACCAACC TCT-SpacerC3。[T(FAM)]代表FAM熒光基團(tuán)修飾的T堿基；[THF]代表四氫呋喃位點(diǎn)；[T(BHQ1)]代表BHQ熒光淬滅基團(tuán)修飾的T堿基；SpacerC3為3＇端的封閉基團(tuán))。將HBV 的3條上游引物(F1、F2和F3)分別與3條下游引物(R1、R2和R3)兩兩搭配成9種組合來(lái)擴(kuò)增103與102拷貝的靶標(biāo)質(zhì)粒DNA，選擇擴(kuò)增曲線最早抬起的F1+R3作為最佳引物組合，用于后續(xù)方法的建立。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 用篩選得到的最佳引物探針組合分別在30、35、37、39及42 ℃這5個(gè)溫度下擴(kuò)增104、103拷貝的HBV質(zhì)粒模板,選擇擴(kuò)增曲線最早抬起的39 ℃作為反應(yīng)的最適溫度，用于后續(xù)方法的考察。

1.2.5 特異性考察 用篩選出的HBV引物探針組合來(lái)擴(kuò)增HBV及其他常見的病原體HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1的104拷貝的質(zhì)粒模板，采用可視化檢測(cè)裝置對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，并與實(shí)時(shí)熒光RPA法進(jìn)行比較，以考察所建立方法的特異性。

1.2.6 靈敏度考察 將HBV質(zhì)粒模板分別梯度稀釋至105、104、103、102、101和100拷貝，進(jìn)行RPA擴(kuò)增，采用可視化檢測(cè)裝置對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，并與實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行比較，以考察所建立方法的靈敏度。

1.2.7 臨床樣本的檢測(cè) 根據(jù)核酸提取試劑盒(磁珠法)步驟提取血清樣本中的HBV DNA。在1.5 mL的離心管中加入25 μL 磁珠，20 μL 蛋白酶K、500 μL裂解液及200 μL樣本，60 ℃水浴15 min，混勻數(shù)次；將離心管置于磁力架上，吸附磁珠，移走管內(nèi)液體；分別用700 μL洗滌液A/B 洗滌磁珠，用磁力架吸附磁珠后移走液體；用50～100 μL洗脫液重懸磁珠，65 ℃水浴5 min, 輕輕搖晃使核酸洗脫下來(lái)；最后用磁力架吸附磁珠，將液體轉(zhuǎn)移至新的無(wú)核酸酶的離心管中，-20 ℃保存。對(duì)20份血清樣本中提取到的病毒DNA進(jìn)行RPA擴(kuò)增，采用可視化檢測(cè)裝置對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，并與實(shí)時(shí)熒光法進(jìn)行比較，以考察所建立方法的臨床適用性。

2 結(jié) 果

2.1 特異性考察 僅有HBV模板出現(xiàn)了比其他模板更強(qiáng)的肉眼可見的熒光信號(hào)，圖像灰度值計(jì)算結(jié)果也證實(shí)了這一結(jié)果；實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果也僅有HBV模板產(chǎn)生了擴(kuò)增曲線，HCV、HIV、TP、HPV16、H1N1和H5N1質(zhì)粒模板與空白對(duì)照均未產(chǎn)生明顯的擴(kuò)增曲線。見圖2。

2.2 靈敏度考察 10拷貝以上的模板均能顯示明顯區(qū)別于陰性對(duì)照的熒光信號(hào)，單拷貝模板的熒光信號(hào)也略強(qiáng)于陰性對(duì)照，圖像灰度值與肉眼判斷的結(jié)果一致。實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線的抬起時(shí)間隨著拷貝數(shù)降低而逐漸延長(zhǎng)，低至101拷貝的HBV質(zhì)粒模板也能產(chǎn)生良好的擴(kuò)增信號(hào)曲線，單拷貝(100)數(shù)量級(jí)的靶標(biāo)也有擴(kuò)增信號(hào)抬起，可與陰性對(duì)照區(qū)分，表明所建立的HBV RPA檢測(cè)方法可檢測(cè)低至1-10拷貝的HBV靶標(biāo)。RPA檢測(cè)HBV質(zhì)粒模板的起始濃度的Log值與擴(kuò)增曲線抬起時(shí)間的線性相關(guān)系數(shù)R2為0.963 3。見圖3。

2.3 臨床樣本的檢測(cè) 用肉眼即可準(zhǔn)確判斷S1-S5為陽(yáng)性樣本，S6-S10為陰性樣本，圖像灰度值與肉眼判斷的結(jié)果相同；實(shí)時(shí)熒光結(jié)果中S1-S5樣本得到了RPA擴(kuò)增曲線，見圖4。表明這5例樣本為HBV陽(yáng)性，S6-S10樣本無(wú)信號(hào)產(chǎn)生，表明為HBV陰性樣本。20份樣本的檢測(cè)結(jié)果與商品化qPCR試劑盒檢測(cè)結(jié)果完全一致(陽(yáng)性均為11份、陰性均為9份)。初步驗(yàn)證了所構(gòu)建的可視化檢測(cè)裝置結(jié)合建立的HBV核酸RPA擴(kuò)增法可實(shí)現(xiàn)對(duì)臨床樣本的檢測(cè)。

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置檢測(cè)結(jié)果；b:熒光灰度值結(jié)果，與空白對(duì)照比較，*P<0.01；c:實(shí)時(shí)熒光信號(hào)曲線

圖2 HBV-RPA擴(kuò)增法檢測(cè)多種病原體的質(zhì)粒模板

Figure 2 The method of HBV-RPA detected multiple pathogens plasmid template.

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置檢測(cè)結(jié)果； b:熒光灰度值結(jié)果，(與陰性對(duì)照比較，*P<0.05、**P<0.01)； c:RPA擴(kuò)增實(shí)時(shí)熒光信號(hào)曲線

圖3 HBV-RPA擴(kuò)增方法靈敏度檢測(cè)結(jié)果

Figure 3 Sensitivity of HBV-RPA detection method

a:RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)結(jié)果； b:熒光灰度值結(jié)果；c:實(shí)時(shí)熒光信號(hào)曲線

S1-S10為樣本編號(hào)；P：HBV陽(yáng)性對(duì)照；N：空白對(duì)照

圖4 10例血清DNA樣本的RPA檢測(cè)結(jié)果

Figure 4 RPA results of 10 serum DNA samples

3 討 論

多年來(lái)，乙肝一直是危害我國(guó)公共衛(wèi)生安全的重大疾病之一?？焖贆z測(cè)HBV對(duì)乙肝的預(yù)防和診斷具有重要意義[15-16]。盡管熒光定量PCR法已被公認(rèn)為是HBV檢測(cè)最可靠的方法，但其依賴精密的熱循環(huán)儀，不利于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。因此，基于等溫?cái)U(kuò)增的核酸檢測(cè)方法在現(xiàn)場(chǎng)快速病原體檢測(cè)中更受青睞[5-6]。其中，RPA技術(shù)因其反應(yīng)條件溫和(37～42 ℃)、擴(kuò)增速度快(15～30 min)、靈敏度高而成為核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中的佼佼者[7-8,17]。本研究通過(guò)設(shè)計(jì)優(yōu)化HBV-RPA擴(kuò)增引物與反應(yīng)條件，建立了基于RPA的HBV核酸擴(kuò)增方法，實(shí)現(xiàn)了在39 ℃下30 min內(nèi)對(duì)低至1～10拷貝的HBV靶標(biāo)DNA的擴(kuò)增檢測(cè)，也表明RPA反應(yīng)相比于其他核酸擴(kuò)增方法具有擴(kuò)增速度快，對(duì)溫控設(shè)備的要求低，擴(kuò)增靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，適合于病原體核酸現(xiàn)場(chǎng)快速擴(kuò)增檢測(cè)。另一方面，HBV擴(kuò)增檢測(cè)的RPA引物與探針的特異性良好，不會(huì)受其他可能同存在于血液中的病毒核酸序列的干擾。一般地，核酸擴(kuò)增與檢測(cè)的特異性還與反應(yīng)溫度有關(guān)，溫度越低其特異性往往不盡如意[18]。但RPA反應(yīng)由于依賴重組酶的序列識(shí)別特性[19]，其特異性足以在較低反應(yīng)溫度下區(qū)分不同序列的病原體靶標(biāo)，這也為RPA進(jìn)行病原體檢測(cè)提供了有力保證。

然而，傳統(tǒng)的RPA技術(shù)需要依賴實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)設(shè)備，儀器成本高，不易推廣。RPA反應(yīng)的定量性能也無(wú)法與PCR媲美，這主要由于RPA擴(kuò)增完全依賴多種酶促反應(yīng)的速率，其擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)不像PCR那樣完全依賴于反應(yīng)循環(huán)數(shù)[3]，所以很難通過(guò)擴(kuò)增抬起時(shí)間對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行定量。因此，采用實(shí)時(shí)熒光法監(jiān)測(cè)RPA反應(yīng)不僅增加了儀器成本，而且難以準(zhǔn)確定量，并不是RPA檢測(cè)的理想方法。基于側(cè)流層析試紙條的方法雖然實(shí)現(xiàn)了對(duì)RPA產(chǎn)物的可視化檢測(cè)，但開管操作帶來(lái)了擴(kuò)增產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，而利用專用的防污染卡套無(wú)疑增加了耗材投入。因而，本研究設(shè)計(jì)制作了一種簡(jiǎn)易的RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置，結(jié)合建立的HBV-RPA擴(kuò)增體系，可實(shí)現(xiàn)手機(jī)拍照、肉眼即可判讀檢測(cè)HBV-RPA擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果。該方法不僅極大降低了RPA應(yīng)用時(shí)的儀器要求，同時(shí)避免了開管檢測(cè)導(dǎo)致的產(chǎn)物交叉污染的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步為開發(fā)基于RPA的病原體現(xiàn)場(chǎng)快速篩查技術(shù)平臺(tái)奠定了基礎(chǔ)。

基于RPA的HBV核酸可視化檢測(cè)方法對(duì)20份臨床血清DNA樣本的檢測(cè)結(jié)果與傳統(tǒng)的qPCR結(jié)果一致，表明該方法具有臨床應(yīng)用的潛力。雖然該方法具有簡(jiǎn)便快速、靈敏特異、儀器成本低的優(yōu)點(diǎn)，但難以實(shí)現(xiàn)HBV的定量，并不適用于HBV臨床治療的療效評(píng)估。但鑒于其在較低溫度下即可進(jìn)行恒溫?cái)U(kuò)增，對(duì)加熱裝置的要求也十分簡(jiǎn)單，后續(xù)可進(jìn)一步改進(jìn)所設(shè)計(jì)的RPA產(chǎn)物可視化檢測(cè)裝置，整合現(xiàn)場(chǎng)快速核酸提取和恒溫加熱模塊，將進(jìn)一步為開發(fā)血液HBV現(xiàn)場(chǎng)快速篩查檢測(cè)平臺(tái)提供有力的技術(shù)支撐。