HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測在宮頸癌篩查的臨床應(yīng)用價值

秦 艷，朱 怡

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200137)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，高危型人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)持續(xù)感染是其發(fā)病的主要原因，早期開展高效篩查有助于預(yù)防癌前病變[1]。宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢測(liquid-based cytology test,LBC或TCT)為宮頸癌篩查的重要手段，但其檢測宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)2級以上病變的靈敏度及陽性預(yù)測值較低，漏診率高。2016年宮頸癌篩查指南將HPV檢測納入宮頸癌篩查中，雖然能提高篩查的靈敏度、病變檢出率，但特異度不足，在檢出CIN2+同時也檢出無臨床意義的HPV感染，使陰道鏡轉(zhuǎn)診與后續(xù)隨訪工作量增加[2]。宮頸癌篩查目的在于檢出疾病而非HPV感染，而E6/E7轉(zhuǎn)錄及翻譯是高危型HPV感染導(dǎo)致宮頸上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的必經(jīng)之路，因此檢測E6/E7較檢測HPV DNA有更高的準(zhǔn)確性及臨床意義[3]。本研究主要分析HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT在上海高橋地區(qū)宮頸癌篩查中的應(yīng)用價值。

1資料與方法

1.1臨床資料

選取2017年1月至2018年12月在上海市第七人民醫(yī)院婦科門診行宮頸癌聯(lián)合篩查的女性1 925例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均有陰道分泌物增多、白帶異常、宮頸糜爛、接觸性出血、宮頸腫物等癥狀；②尚未接受系統(tǒng)治療，知情同意取宮頸脫落細(xì)胞及宮頸活檢組織進(jìn)行檢查；③24h內(nèi)無性生活且無宮頸放射治療史。排除標(biāo)準(zhǔn)：①因良性疾病需切除子宮；②有宮頸癌與癌前病變(包括CIN2級、CIN3級)史；③其他婦科惡性腫瘤；④人類免疫缺陷病毒(HIV)感染及器官移植。依據(jù)宮頸篩查方法分為：對照組(HPV DNA+TCT篩查)1 050例、觀察組(高危型HPV E6/E7 mRNA+TCT篩查)875例。對照組年齡30～65歲，平均(47.18±4.96)歲；病程1～3個月，平均(2.41±0.26)個月。觀察組年齡31～65歲，平均(47.12±4.99)歲；病程1～3個月，平均(2.46±0.23)個月。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法

受試者均同時留取TCT、HPV標(biāo)本，取材前3d無陰道沖洗及陰道用藥史。采集方法：①采用凱普宮頸細(xì)胞收集保存系統(tǒng)與去RNA酶宮頸細(xì)胞保存系統(tǒng)采集宮頸細(xì)胞標(biāo)本各1份；②放置陰道擴(kuò)張器，采用無菌棉球拭去宮頸分泌物；③將新柏氏液基細(xì)胞學(xué)(TCT)檢測專用采樣刷放置在宮頸鱗柱狀上皮交界處，并順時針旋轉(zhuǎn)，旋轉(zhuǎn)3～5圈后將采樣器前端折斷，放置在含專用細(xì)胞保存液的專用試管中，室溫下保存待測。

1.2.2篩查方法

1.2.2.1 TCT篩查 采用膜式液基超薄細(xì)胞學(xué)和離心沉淀技術(shù)，對宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行固定、染色，由檢驗科醫(yī)師依據(jù)國際癌癥協(xié)會推薦的Bethesda系統(tǒng)(The Bethesda System,TBS，2001年)進(jìn)行宮頸細(xì)胞學(xué)診斷，包括：未見上皮內(nèi)病變細(xì)胞或惡性細(xì)胞(NILM)、不能明確意義的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCUS)、不能除外上皮內(nèi)高度病變的非典型鱗狀細(xì)胞(ASCH)、鱗狀上皮內(nèi)低度病變(LSIL)、鱗狀上皮內(nèi)高度病變(HSIL)、鱗狀細(xì)胞癌(SCC)[4]。

1.2.2.2 HPV E6/E7 mRNA檢測 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測HPV E6/E7 mRNA(QuantiVirusTM，科蒂亞)水平，以導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)(HybridMax，凱普)在TCT結(jié)果未知的情況下獨(dú)立進(jìn)行檢測，可檢測15種高危型HPV和7種低危型HPV。將待測標(biāo)本離心棄去上清液，加入裂解液、蛋白酶K，恒溫保存1.5h，取出標(biāo)本振蕩，加入96孔檢測板，并設(shè)空白對照2孔、陽性質(zhì)控2孔，經(jīng)2種捕獲探針捕獲目的mRNA，采用3級信號放大，加底物及催化劑，進(jìn)行病毒mRNA雜交，生成支鏈DNA(bDNA)復(fù)合物，以堿性磷酸酶標(biāo)記的發(fā)光探針雜交到固相復(fù)合物上，采用突光檢測儀檢測標(biāo)本發(fā)光值，按拷貝數(shù)進(jìn)行計算，以相對發(fā)光強(qiáng)度(RLUs)比≥1診斷為HPV E6/E7 mRNA陽性。

1.2.2.3陰道鏡檢測 轉(zhuǎn)診陰道鏡標(biāo)準(zhǔn)：細(xì)胞學(xué)≥ASCUS，統(tǒng)計時以TBS≥LSIL及ASCUS/HPV+為標(biāo)準(zhǔn)計算聯(lián)合篩查的陰道鏡轉(zhuǎn)診率，陰道鏡由專職陰道鏡醫(yī)師操作。細(xì)胞學(xué)與HPV檢測均呈陰性者認(rèn)為無宮頸病變，不必接受陰道鏡檢查與活檢。

1.2.2.4結(jié)果判讀 由我院經(jīng)驗豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及組織病理學(xué)閱片，診斷意見不一致時另請2位高年資病理醫(yī)師一起閱片，將≥2位病理醫(yī)師的統(tǒng)一意見作為最終結(jié)果?；顧z結(jié)果采用Richart標(biāo)準(zhǔn)分級，分為正常、CIN1級、CIN2級、CIN3級/浸潤性宮頸癌(invasive cervical cancer，ICC)?；颊邼M意度評估：應(yīng)用Zung氏焦慮自評量表系統(tǒng)評估患者焦慮程度，<60分提示無或輕度焦慮，為滿意；≥60分提示中重度焦慮，為不滿意[5]。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1兩組篩查結(jié)果比較

觀察組HPV E6/E7 mRNA初篩陽性率為31.09%(272/875)，低于對照組HPV DNA初篩陽性率39.14%(411/1 050)，χ2=13.535，P<0.01。

2.2不同Bethesda分類患者的HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA陽性率比較

Bethesda分類中，NILM、LSIL、HSIL患者的HPV DNA陽性率高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.01)，且總體HPV DNA陽性率高于HPV E6/E7 mRNA陽性率(P<0.01)，而在ASCUS、ASCH、SCC中HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 不同Bethesda分類患者的HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA陽性率比較[n(%)]

2.3不同病理分級患者的HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果比較

隨著病理分級增加，HPV E6/E7 mRNA陽性率、HPV DNA陽性率及mRNA拷貝數(shù)上升(P<0.01)，DNA拷貝數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果顯示：CIN3級/ICC患者HPV E6/E7 mRNA陽性率明顯高于正常、CIN1級、CIN2級患者(χ2值分別為67.481、37.525、37.622，均P<0.05)；CIN3級/ICC患者mRNA拷貝數(shù)明顯高于正常、CIN1級、CIN2級患者(t值分別為117.88、36.503、24.238，均P<0.05)；CIN3級/ICC患者HPV DNA陽性率明顯高于正常、CIN1級、CIN2級患者(χ2值分別為84.864、78.233、87.488，均P<0.05)。CIN1級、CIN2級、CIN3級患者HPV DNA陽性率、HPV E6/E7 mRNA陽性率比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，見表2、表3。

表2 觀察組不同病理分級患者的HPV DNA檢測結(jié)果比較

注：*P<0.05。

表3 對照組不同病理分級患者的HPV DNA檢測結(jié)果比較

注：*P<0.05。

2.4兩組陰道鏡轉(zhuǎn)診率、滿意度比較

觀察組陰道鏡轉(zhuǎn)診率低于對照組，患者滿意度高于對照組(均P<0.01)，見表4。

2.5不同檢測方法的篩查價值比較

HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為37.40%(181/484)、98.72%(386/391)、64.80%(567/875)，HPV DNA聯(lián)合TCT篩查的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度分別為19.97%(116/581)、67.59%(317/469)、41.23%(433/1 050)，見表5。HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查評估高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN分級2～3級)及宮頸癌的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度高于HPV DNA聯(lián)合TCT篩查(χ2值分別為39.894、138.474、106.147，均P<0.05)。

表4 兩組陰道鏡轉(zhuǎn)診率、患者滿意度比較[n(%)]

表5 兩種不同檢測方法的篩查價值比較(n)

3討論

3.1宮頸癌的診斷及HPV E6/E7 mRNA應(yīng)用前景

HPV感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的重要因素，研究證實，HPV基因組早期區(qū)編碼可干擾細(xì)胞周期調(diào)控的E6/E7癌蛋白，高危型HPV E6/E7是病毒致癌基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，參與宿主細(xì)胞靶向結(jié)合，其表達(dá)及轉(zhuǎn)錄數(shù)量直接決定著細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的可能性[6]。HPV E6/E7 mRNA作為有活性的癌基因在宮頸組織中表達(dá)，若癌基因無表達(dá)，則提示該癌基因無活性，不會發(fā)生癌變，因此可依據(jù)HPV E6/E7 mRNA的表達(dá)對宮頸上皮病變進(jìn)展風(fēng)險進(jìn)行有效評估，以更準(zhǔn)確地判斷宮頸上皮內(nèi)病變程度與預(yù)后[7]。

3.2 HPV DNA聯(lián)合TCT篩查及HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查結(jié)果

本研究中，1 050例女性接受HPV DNA聯(lián)合TCT篩查，875例接受HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查。結(jié)果顯示，觀察組中HPV E6/E7 mRNA初篩陽性率為31.09%(272/875)，較對照組中HPV DNA初篩陽性率39.14%(411/1 050)低，與王娟等[8]報道的406例患者中，HPV DNA陽性率47.0%高于HPV E6/E7 mRNA檢測陽性率31.2%的結(jié)果一致。當(dāng)前HPV的分子診斷方法主要依賴于對HPV DNA標(biāo)記物檢測，HPV檢測是病因?qū)W依據(jù)，但無法判斷出其感染宮頸的具體階段及癌基因活性程度，而相對來說，HPV E6/E7標(biāo)記物則能表達(dá)癌基因在宮頸組織中的活性，E6蛋白會與P53蛋白、泛素連接酶結(jié)合而生成三聚體復(fù)合物，導(dǎo)致P53蛋白失去抑癌活性，E7蛋白則可調(diào)控多種蛋白并使細(xì)胞無限增殖、癌變，且E6、E7蛋白的共同表達(dá)可發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)轉(zhuǎn)化能力，使細(xì)胞過度增殖，最終引起宮頸癌的發(fā)生，因而HPV E6/E7 mRNA可作為一個評估宮頸癌風(fēng)險的較好指標(biāo)[9]。

3.3 HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA陽性率與Bethesda分類的關(guān)系分析

本研究發(fā)現(xiàn)在Bethesda分類中，NILM、LSIL、HSIL患者的HPV DNA陽性率高于HPV E6/E7 mRNA陽性率，而總體HPV DNA陽性率也高于HPV E6/E7 mRNA陽性率，表明部分HPV感染患者尚未引起宿主細(xì)胞的病理改變。在診斷為ASCUS、ASCH、SCC患者中，HPV DNA陽性率與HPV E6/E7 mRNA陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，這與既往文獻(xiàn)報道一致[10-11]。因此在篩查出ASCUS及以上患者中，兩種方法檢測效能相近。

3.4 HPV DNA及HPV E6/E7 mRNA檢測結(jié)果與病理分級的關(guān)系分析

本研究也顯示，隨著病理分級增加，HPV E6/E7 mRNA陽性率、HPV DNA陽性率增加，且病理分級增加，mRNA拷貝數(shù)上升，而DNA拷貝數(shù)未發(fā)生明顯變化，這與李劍等[12]的報道結(jié)果相似，提示HPV E6/E7 mRNA檢測可能具有更高的敏感度，HPV基因與宮頸細(xì)胞基因整合是導(dǎo)致CIN轉(zhuǎn)化為宮頸癌的重要原因，宿主感染HPV病毒后，因為HPV病毒過度表達(dá)E6/E7而引發(fā)免疫逃逸，促進(jìn)正常細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞[13]，且Sotirija等[14]的動物實驗也發(fā)現(xiàn)HPV E6、E7蛋白過度表達(dá)會抑制抑癌基因表達(dá)而激活端粒酶，影響細(xì)胞周期的調(diào)控，使宮頸組織細(xì)胞增殖率上升，發(fā)生宮頸癌變。近期一項大規(guī)模Meta研究(44 477例)也發(fā)現(xiàn)，HPV E6/E7 mRNA檢測在宮頸癌篩查中有較高價值，可作為宮頸癌病變啟動監(jiān)測指標(biāo)，提早發(fā)現(xiàn)高級別病變，并進(jìn)行臨床干預(yù)[15]。

3.5 HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT的篩查價值

本研究HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT篩查評估高級別宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌的患者的靈敏度、特異度高于HPV DNA聯(lián)合TCT篩查，與既往研究報道一致，且觀察組陰道鏡轉(zhuǎn)診率低于對照組，而患者滿意度較對照組高，說明HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT可能具有更高的篩查價值[16-17]。但兩種檢測方法的靈敏度仍較低，因此在篩查子宮頸癌中，細(xì)胞形態(tài)學(xué)低敏感性及HPV DNA標(biāo)記物檢測的低特異性均需要提高，采用更具有特異性的方法進(jìn)行演算而非采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)及HPV DNA檢測，尤其對于年輕群體，可能選擇HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT具有更高的篩查價值，國外也有關(guān)于推薦采用HPV E6/E7 mRNA檢測評估宮頸上皮內(nèi)瘤變患者治療后的復(fù)發(fā)風(fēng)險的研究[18]。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA聯(lián)合TCT檢測在高橋地區(qū)宮頸癌篩查中具有較高臨床價值，未來可作為重要輔助檢測手段。