鹿筋膠原蛋白提取條件優(yōu)化

張鵬程， 幺寶金， 冷向陽

(長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130021)

鹿筋最初記載于《唐本草》[1]，為鹿科動物梅花鹿或馬鹿四肢的筋，用于治療腎虛引起的手足無力、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、勞損、轉(zhuǎn)筋等癥。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，鹿筋膠原蛋白具有抗炎、鎮(zhèn)痛、增強機體免疫力、治療骨質(zhì)疏松等作用。鹿筋的主要成分是膠原蛋白，膠原蛋白的水解產(chǎn)物含多種氨基酸，所以更豐富了鹿筋的藥用及食用價值。膠原蛋白(collagen)是一種生物性高分子物質(zhì)，是一種白色、不透明、無支鏈的纖維性蛋白質(zhì)。膠原蛋白主要分布在哺乳動物的結(jié)締組織中，對動物和人體皮膚、血管、骨骼、筋腱、牙齒和軟骨的形成都十分重要，是這些結(jié)締組織的主要物質(zhì)基礎(chǔ)。

膠原蛋白是最豐富的蛋白質(zhì)之一，可以從多種動物身上提取[2]。目前對于膠原蛋白提取的主要方法有：酸提取法、堿提取法、酶提取法、酸酶結(jié)合提取法、堿酶結(jié)合提取法等[3]。該研究在半仿生學(xué)狀態(tài)下對其鹿筋膠原蛋白的提取條件進行優(yōu)化。人體內(nèi)的胃酸主要是0.2%～0.5%的HCL，胃蛋白酶及胰蛋白酶為人體主要的消化酶，胃蛋白酶的最適宜溫度為37 ℃，pH值約2.0～3.0，胰蛋白酶的最適宜溫度為37 ℃，pH值約7.0～8.0。該研究選擇酸—酶結(jié)合提取法做為試驗的主要方法，旨在得到純度更高的鹿筋膠原蛋白，為后續(xù)相關(guān)工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑、儀器

梅花鹿鹿筋購自吉林省長春市雙陽區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)；胃蛋白酶(1∶3 000)、胰蛋白酶(1∶250)、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值8.8)、1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH值6.8)、10 % SDS、30%制膠液(29∶1)購自北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)購自碧云天生物公司；過硫酸銨溶液(AP，10%)購自上海原液生物科技公司；4×Laemmli Sample Buffer購自Bio-Rad美國；Cell Counting Kit-8購自BOSTER公司；Infnite200 PRO型酶標儀購自Life Sciences公司；pH儀購自Mettler Toledo公司。

1.2 方法

1.2.1 鹿筋的處理

取新鮮鹿筋，剔除肌肉組織、脂肪組織、筋膜等其他組織，保留新鮮鹿筋原料，并將剔好的鹿筋用剪刀或手術(shù)刀切成0.3 cm×0.3 cm×0.3 cm的鹿筋顆粒，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 鹿筋膠原蛋白的提取方法

將鹿筋解凍，醋酸溶液浸泡后置于100 ℃沸水浴中至其完全溶解，將水解液于20 ℃條件下9 500 r/min離心15 min；離心后取上清液調(diào)節(jié)pH值為2.0，向上清液中加胃蛋白酶，放置37 ℃搖床酶解；酶解后得到膠原蛋白粗液，90 ℃加熱10 min，使胃蛋白酶失活；20 ℃、9 500 r/min 離心15 min，取上清液經(jīng)冷凍干燥得到膠原蛋白。每組試驗3次重復(fù)。

1.2.3 膠原蛋白提取的評定指標

不同醋酸體積分數(shù)、煎煮時間、浸提時間等均會對鹿筋膠原蛋白提取造成影響。酸量過少、煎煮時間不足、浸提時間短會使膠原蛋白提取時不易溶解，從而影響回收效率；酸量過大、煎煮時間過長均會造成膠原蛋白中一些氨基酸變性，而且酸濃度過大會引入過多的離子；酸濃度適當時，鹿筋在100 ℃ 沸水中溶解較快而且比較充分并且回收效率較高。因此，醋酸濃度、煎煮時間、浸提時間以鹿筋凍干回收率作為評價指標。

1.2.4 膠原蛋白含量的測定

應(yīng)用BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)完成。標準曲線的繪制：將 0、1、2、4、8、12、16、20 μL標準品加到96孔板中，加標準品稀釋液補足到20 μL，各孔加入200 μL BCA工作液，37 ℃放置20～30 min。用酶標儀測定595 nm處的光密度值。以蛋白濃度/mg·mL-1為橫坐標，光密度值為縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.5 SDS蛋白電泳

樣品制備 稱取適量樣品，溶解至50 mg/mL，按照1∶3加入4×Laemmli Sample Buffer，混勻，100 ℃沸水煮5 min。存放于-20 ℃冰箱中保存。配制10%分離膠及12%壓縮膠于1.5 mm制膠板中，每孔加40 μL樣品。S1壓縮膠時間為30 min，S2分離膠時間為50 min。將完成的電泳膠放入容器盒中倒入染色液，放入37 ℃、70 r/min搖床中染色1 h，用配制好的脫色液(225 mL甲醇、225 mL超純水、50 mL乙酸)脫色2次，每次30 min；將膠片放在白色背景板下觀看。

1.2.6 單因素試驗

1.2.6.1 不同醋酸體積分數(shù)對提取的影響

稱取21 g 鮮鹿筋平均分成7份，每份3 g，按料液比1∶50加入配制好的體積分數(shù)為0、0.5%、1%、3%、5%、8%、10%的醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min 搖床振蕩48 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定最佳醋酸體積分數(shù)。

1.2.6.2 不同煎煮時間對提取的影響

稱取15 g鮮鹿筋平均分成5份，每份3 g，加入配制好的體積分數(shù)為5%的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 搖床振蕩48 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮時間為1、1.25、1.5、1.75和2 h，根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定最佳煎煮時間。

1.2.6.3 不同浸提時間對提取的影響

稱取15 g鮮鹿筋平均分成5份，每份3 g，加入配制好的體積分數(shù)為5%醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min搖床振蕩6、12、24、48和72 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定最佳浸提時間。

1.2.6.4 不同酶的種類對提取的影響

稱取9 g鮮鹿筋平均分成3份，每份3 g，加入配制好的體積分數(shù)為5 %的醋酸溶液。置于4 ℃、120 r/min 搖床振蕩48 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，分別做不加酶處理，用濃HCL調(diào)節(jié)pH值至2.0加胃蛋白酶及用10 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5胰蛋白酶處理，酶解12 h根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定酶的選擇。

1.2.6.5 不同酶底比對提取的影響

稱取18 g 鮮鹿筋平均分成6份，每份3 g，加入配制好的體積分數(shù)為5 %的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 搖床振蕩48 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，調(diào)節(jié)pH值至2.0，把胃蛋白酶配成一定濃度的溶液，然后按照酶和底物的比例分別為0∶1(不加入胃蛋白酶)、1∶300、1∶500、1∶1 000、1∶1 500和1∶2 000(g/g)加入胃蛋白酶溶液，酶解12 h，根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定最佳酶底比。

1.2.6.6 不同酶解時間對提取的影響

稱取12 g鮮鹿筋平均分成4份，每份3 g，加入配制好的體積分數(shù)為5 %的醋酸溶液。 置于4 ℃、120 r/min 搖床振蕩48 h，然后取出恢復(fù)室溫后置于100 ℃沸水中提取，煎煮1.5 h，調(diào)節(jié)pH值至2.0，按照酶底比分別加入1∶1 000的胃蛋白酶，分別酶解6、12、18和24 h，根據(jù)鹿筋凍干后回收率確定最佳酶解時間。

1.2.7 正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，對醋酸體積分數(shù)(A)、浸提時間(B)、煎煮時間(C)3個因素，每個因素3個水平采用L9(33)正交表進行試驗驗證，對鹿筋膠原蛋白提取條件進行優(yōu)化。

1.2.8 細胞增殖活性試驗

應(yīng)用細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(Cell Counting Kit-8)完成。傳代培養(yǎng)MC3T3成骨細胞，獲得細胞懸液，按照3×104個/mL(每孔100 μL)接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，將過膜除菌后的鹿筋提取物按如下濃度梯度溶于DMEM培養(yǎng)液中：0、4、5、6、7、8、9和10 mg/mL；按照100 μL/孔將不同濃度藥物加入96孔板中，放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，避光條件下向每孔加入10 μL Cell Counting Kit-8試劑，再次孵育30 min，應(yīng)用酶標儀檢測450 nm處吸光度，計算細胞增殖率。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)皆為3次試驗的平均值和標準差。各組間比較采用成組t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 醋酸體積分數(shù)的確定

由圖1可知，隨著醋酸體積的增加，鹿筋的回收率會隨之增加，在醋酸體積分數(shù)為5 %時，回收率最高，因此，選用醋酸體積分數(shù)為5 %。

2.1.2 煎煮時間的確定

煎煮1.25 h時鹿筋可充分溶解，由圖2可知，煎煮1.25 h與煎煮1.75 h收率相差無幾，故選用最佳煎煮時間為1.25 h。

圖2 不同煎煮時間對鹿筋回收率的影響

2.1.3 浸提時間的確定

由圖3可知，隨著浸提時間的增加，鹿筋膠原的回收效率也隨之增加，當達到48 h時達到峰值，因此，選擇48 h為最佳浸提時間。

圖3 不同浸提時間對鹿筋回收率的影響

2.1.4 酶種類的確定

根據(jù)圖4可知，加入胰蛋白酶與未加酶的相比較，回收率基本一樣，且加入胰蛋白酶會引入大量的鹽，加入胃蛋白酶回收率會顯著增加，因此，選擇加入胃蛋白酶。

圖4 不同酶的種類對鹿筋回收率的影響

2.1.5 不同酶底比的確定

由圖5可知，按照酶底比1∶1 000加入胃蛋白酶的鹿筋回收率較高，因此，選擇1∶1 000胃蛋白酶為最佳酶底比。

圖5 不同酶底比對鹿筋回收率的影響

2.1.6 不同酶解時間的確定

由圖6可知，酶解6 h時，鹿筋回收率較高，因此，最佳酶解時間為6 h。

圖6 不同酶解時間對鹿筋回收率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，確定正交試驗的因素與水平(表1)。正交試驗結(jié)果及方差結(jié)果見表2、3。

表1～3的結(jié)果表明，極差R值顯示不同醋酸體積分數(shù)、浸提時間、煎煮時間單因素對鹿筋提取含量的影響程度不同，作用主次分別為 C>A>B；即煎煮時間>不同醋酸體積分數(shù)>浸提時間。經(jīng)方差分析F值分析可知，不同醋酸體積分數(shù)、浸提時間、煎煮時間這3個因素對鹿筋膠原的提取效果不具有顯著性差異，所以最佳提取工藝為A2 B2 C3。

表1 正交試驗因素水平表

表2 正交試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

2.3 正交試驗電泳結(jié)果

蛋白電泳可以提示應(yīng)用酸酶結(jié)合的方法，提取出來膠原蛋白(圖7)。圖中藍色印記越深，代表蛋白含量越高，試驗所提取的蛋白主要集中在15～35 kDa，說明蛋白水解充分，大多數(shù)都水解成為小分子蛋白。提取方法有效可行。

注：從左至右分別為Marker、正交試驗序號1、2、3、4、5、6、7、8、9。

圖7 正交試驗電泳結(jié)果

Fig.7 Results of orthogonal test electrophoresis

2.4 細胞增殖活性試驗

以0 mg/mL作為空白對照，利用CCK-8試劑檢測鹿筋膠原在不同濃度下干預(yù)MC3T3細胞24 h后的增殖活性，鹿筋膠原蛋白在給藥濃度到4 mg/mL時，細胞開始增殖，到8 mg/mL時達到峰值，超過8 mg/mL時增殖趨勢下滑(圖8)。各加藥組與空白對照組之間通過t檢驗計算MC3T3處理的存活率差異。鹿筋膠原在8 mg/mL時，差異極顯著(P<0.01)。因此，可以確定8 mg/mL是最佳活性濃度。

注：*代表P<0.05，**代表P<0.01。

3 討論與結(jié)論

古代藥典及中醫(yī)經(jīng)典古籍對于鹿筋的記載相對較少，主要由于古代其野生性，物品稀缺及處理復(fù)雜，無法廣泛使用。目前，在人工飼養(yǎng)后，鹿產(chǎn)品的產(chǎn)量被大大的提高，鹿筋做為一個食材為主、藥用為輔的材料也廣泛被認知及應(yīng)用。現(xiàn)代藥理研究表明，鹿筋膠原蛋白的抗炎[4]、鎮(zhèn)痛[5]效果顯著、在增強機體免疫力[6]方面也有顯著的效果。膠原蛋白具有復(fù)雜的層次結(jié)構(gòu)，可分為4種結(jié)構(gòu)[7]。 到目前為止，大約有28種類型的膠原[7]已經(jīng)被鑒定出來，I型膠原最普遍的類型，特別是在肌腱和骨骼等組織中[7-8]。I型膠原的缺失可導(dǎo)致成骨不全及許多退行性疾病[9]。II型膠原是軟骨組織中存在的主要膠原類型[10]。膠原蛋白在生物醫(yī)學(xué)中主要有皮膚替代品[11]、骨修復(fù)[12]、腱修補[13]、軟骨修復(fù)[14]、神經(jīng)修復(fù)[15]等應(yīng)用。

張鶴[16]、陳海燕[17]等對鹿筋膠原進行提取時，以鹿筋在100 ℃沸水中的溶解時間做為提取膠原的評價指標，采用Folin-酚試劑盒測膠原蛋白含量，得到的鹿筋膠原提取條件與本研究略有差別。該研究主要以膠原的回收效率做為衡量的標準，并且在進行凍干時，并未調(diào)整pH值至中性條件，避免了酸堿中和產(chǎn)生的大量的鹽，所以得到的回收率會更加準確。另外，BCA蛋白濃度測定試劑盒的敏感度也會略高于Folin-酚試劑盒，對于小分子蛋白的測定也會更加準確。該研究與其不同點在于應(yīng)用回收率衡量酶量，所得結(jié)果與高效益相色譜所得到的結(jié)果一致，這樣既縮短了實驗時長，又減少了高效液相繁瑣的操作步驟，為實驗提供了便利。前兩者的研究均以酶解24 h做為最佳酶解時間，而該研究以回收率做為衡量標準的同時，又考慮環(huán)境因素對膠原帶來的影響，37 ℃的環(huán)境有極大的可能會導(dǎo)致樣品出現(xiàn)變質(zhì)的可能，所以該研究把酶解時間縮短到6 h。

MC3T3細胞是小鼠胚胎成骨細胞，是體外研究骨細胞分化的良好模型。試驗中通過胃蛋白酶制取的鹿筋膠原蛋白對MC3T3細胞有明顯的增殖效果，說明鹿筋有一定的強筋健骨之功。骨質(zhì)疏松癥主要是由于成骨細胞與破骨細胞的平衡關(guān)系被打破[18-19]，以至于破骨細胞過于活躍，骨質(zhì)溶解過多，而膠原蛋白對成骨細胞的增殖作用可以有效地促進成骨增殖分化，有效緩解骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展進程，對骨質(zhì)疏松癥的治療起到一定的作用。

根據(jù)單因素試驗及正交試驗驗證得出最佳工藝條件為：醋酸體積分數(shù)5% ，浸泡時間48 h，煎煮時間1.5 h，胃蛋白酶用量1∶1 000，酶解時間6 h。試驗中采用胃蛋白酶制備的鹿筋膠原蛋白多肽，對MC3T3細胞均具有顯著的增殖作用，由此可以說明鹿筋膠原蛋白多肽具有鹿筋原藥材的強筋壯骨等功效。但對MC3T3細胞增殖的機理還有待于進一步研究。該研究對于具有補肝腎、強筋骨的鹿產(chǎn)品研發(fā)提供了數(shù)據(jù)。