淋巴結(jié)組織術(shù)中冷凍切片常見問題與對策

王 偉，朱惠君

在臨床術(shù)中送檢的快速病理標(biāo)本中，淋巴結(jié)是含脂肪較多的組織之一，周圍脂肪很難剔除干凈，組織結(jié)構(gòu)致密、細(xì)胞豐富，其外周又有致密結(jié)締組織的被膜包裹，難以凍結(jié)，切片呈糊狀，需要較低的溫度進(jìn)行冷凍。但冷凍溫度過低，又易使淋巴結(jié)組織變脆，不能滿足鏡檢要求，極易造成漏診，與其他組織相比其制片難度較大[1]。本科室在實(shí)際工作中對術(shù)中同時(shí)送檢的多個(gè)淋巴結(jié)組織冷凍切片進(jìn)行實(shí)踐和探索，取得滿意效果。鏡下觀察，淋巴結(jié)組織結(jié)構(gòu)完整，胞質(zhì)與胞核紅藍(lán)對比鮮明，實(shí)質(zhì)細(xì)胞無收縮，與常規(guī)石蠟切片觀感結(jié)果較一致(圖1)?，F(xiàn)就術(shù)中冷凍淋巴結(jié)組織制片中常見問題與對策進(jìn)行總結(jié)，并介紹如下。

1 切片有裂隙、顫痕或碎沫樣改變

1.1 原因 多出現(xiàn)有腫瘤轉(zhuǎn)移或反應(yīng)性增生等實(shí)質(zhì)細(xì)胞改變的淋巴結(jié)組織切片，特點(diǎn)是淋巴結(jié)實(shí)質(zhì)細(xì)胞致密，造成組織冷凍后硬度較大所致。

1.2 對策 參考臨床病理室間質(zhì)控評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的冷凍切片標(biāo)準(zhǔn)[2]，將恒冷切片機(jī)的箱體溫度調(diào)在適合淋巴結(jié)組織切片的最佳溫度-18～-20 ℃，將淋巴結(jié)組織置于冷凍托底座上，周圍滴加OCT包埋劑，冷凍1～2 min，6 μm厚切片，即可順利切出切片。

1.3 注意 (1)取材前應(yīng)先用濾紙吸取淋巴結(jié)組織表面的水分，防止冰晶形成。(2)盡可能剔除淋巴結(jié)組織周圍的脂肪，避免脂肪過多導(dǎo)致切片困難。(3)防止取材手法不當(dāng)或者刀鈍造成淋巴結(jié)組織擠壓受損，導(dǎo)致鏡下結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。(4)冷凍時(shí)間亦不宜過長，否則實(shí)性成分容易過度冷凍，切片易產(chǎn)生皺褶、發(fā)脆。

2 組織切片呈糊狀，堆積在一起或者黏附在切片刀上，難以展平

2.1 原因 脂肪組織所含水分極少，難以像其它組織一樣被凍硬，所以被脂肪成分包裹的淋巴結(jié)組織易皺褶、卷曲、黏稠不成片。通常箱體溫度在-18 ℃左右，樣品頭溫度-20 ℃左右，這樣就能將一般的組織切出6 μm厚的平整切片。但對于被脂肪成分包裹的淋巴結(jié)組織，即使溫度調(diào)制-30 ℃，脂滴也不易被凍硬，很難切出滿意的切片。

2.2 對策 取材時(shí)盡可能把淋巴結(jié)周圍的脂肪組織用刀剔除干凈，或者用擠壓的方法，將被脂肪組織包裹的淋巴結(jié)組織置于多層干凈紗布之間，手指輕壓紗布中的組織，使脂肪組織中的脂質(zhì)成分被擠壓出去。也可用粗切削的方式將組織粗修至最大平面后，再用冷凍錘輕壓切面，然后順著原粗修切片的方向快速切片，也取得較好效果。

2.3 注意 (1)含脂質(zhì)較多的淋巴結(jié)組織容易掉片，切片厚度不宜超過6 μm，且切片過厚會導(dǎo)致細(xì)胞重疊，鏡下結(jié)構(gòu)不清晰。(2)用擠壓的方法盡量保持組織原有形態(tài)，減少組織受壓引起損傷，結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。(3)采用全新的優(yōu)質(zhì)一次性不銹鋼刀片，最好不用檔板，直接快速切片，可以減少刀片和冷凍組織摩擦?xí)r產(chǎn)生的熱量，慢搖切片機(jī)使細(xì)胞容易堆積、重疊。

3 切片時(shí)組織脫落、脆裂，不完整，切面常有空洞，部分糊狀

3.1 原因 既有實(shí)性成分又有脂肪成分的多個(gè)淋巴結(jié)組織，則切出的薄片空洞，破碎，切片不完整，切片困難(圖2)；要切出脂肪，需在低溫下才能使脂肪冷凍，且耗時(shí)較長，而溫度太低，實(shí)性部分往往容易過度冷凍。

3.2 對策 使用適當(dāng)?shù)陌穹椒?，將恒冷切片機(jī)的箱體溫度調(diào)為-18 ℃，同時(shí)將實(shí)性成分和脂肪成分為主的淋巴結(jié)組織分別包埋固定在一樣品頭的上、下方，兩者盡可能緊靠，實(shí)性成分?jǐn)[在凍頭下方，靠近刀口的位置；脂肪成分?jǐn)[在凍頭的上方，遠(yuǎn)離刀口的位置，這樣先切實(shí)性部分，用毛筆輕拉切片，有利于展平上方的組織。否則兩種成分混合冷凍在1個(gè)凍頭上，難以切完整，易形成大的空洞。也可預(yù)先在淋巴結(jié)組織大體檢查時(shí)，通過肉眼觀察將含實(shí)性成分和脂肪成分的淋巴結(jié)組織分開冷凍固定在2個(gè)凍頭上，然后分別按照上述1.2和2.2的對策處理即可，減少人為的空洞現(xiàn)象，能順利切出滿意切片(圖3)。

使用術(shù)中印片細(xì)胞學(xué)檢測[3]，將術(shù)中新鮮淋巴結(jié)組織直接放在紗布上，用解剖刀沿淋巴結(jié)的最大面剖開，或者在冷凍機(jī)的樣品頭上粗修至最大平面，然后將準(zhǔn)備好的干凈防脫膠載玻片立即對著病灶明顯的剖面或最大平面，印片4～6張(圖4)，隨即固定，染色即可，操作簡便，能真實(shí)反映細(xì)胞形態(tài)，診斷準(zhǔn)確性高。與冷凍組織切片的診斷符合率相似，有助于病理醫(yī)師發(fā)出臨時(shí)報(bào)告。

①②③④

圖1 淋巴結(jié)組織術(shù)中切片鏡下觀與常規(guī)HE觀感相似 圖2 淋巴結(jié)組織切成糊狀，空洞，不完整 圖3 切出較完整的淋巴結(jié)切片 圖4 印片細(xì)胞學(xué)方法制片

3.3 注意 印片時(shí)動作輕柔、用力均勻，不能來回摩擦，否則會導(dǎo)致細(xì)胞重疊影響診斷。有研究報(bào)道[3]，用該方法制成的淋巴結(jié)組織術(shù)中切片和常規(guī)石蠟制片的準(zhǔn)確率相似，對印片細(xì)胞學(xué)在淋巴結(jié)組織術(shù)中診斷中的地位給予充分的肯定，但是該方法對診斷淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移尚有缺陷。建議可在因制片時(shí)間有限，且難以按上述方法切出理想切片時(shí)考慮該方法。

4 送檢多個(gè)淋巴結(jié)組織切不完整，造成漏診

4.1 原因 大小不一、圓形或橢圓形等多個(gè)淋巴結(jié)組織，因切片時(shí)高度不在一個(gè)平面上，造成較小淋巴結(jié)的誤、漏診。

4.2 對策 將較小的和較大的淋巴結(jié)組織分開包埋，將較小的淋巴結(jié)組織單獨(dú)制作一個(gè)OCT包埋托，先滴加OCT包埋劑，做成一個(gè)凍臺，再把淋巴結(jié)組織包埋進(jìn)其中，排列不能太分散，以利于切片。然后將較大的淋巴結(jié)組織冷凍在另一個(gè)樣品頭上，隨后分別切片，常規(guī)冷凍切片HE染色。如遇疑難制片，再按上述方法處理。

4.3 注意 (1)為減少或避免發(fā)生誤、漏診，需將淋巴結(jié)組織同時(shí)切完整。(2)在提高淋巴結(jié)組織制片質(zhì)量的基礎(chǔ)上，多做幾個(gè)切面的冷凍切片，以滿足病理醫(yī)師的診斷要求。

綜上所述，針對術(shù)中冷凍中淋巴結(jié)組織不同情況應(yīng)采取不同方法，當(dāng)遇到切片問題，按上述操作方法解決后，有利于制作出較為滿意的淋巴結(jié)切片，便于術(shù)中快速冷凍病理診斷及后續(xù)手術(shù)方案的選擇。