非小細(xì)胞肺癌中KiSS-1、MMP-2和MVD的表達(dá)及意義

趙天源，常延河，張艷敏，夏彥東

肺癌是對(duì)人類威脅極大的惡性腫瘤，其發(fā)病率和病死率位居全球前列[1]，腫瘤轉(zhuǎn)移是造成患者預(yù)后不良的主要原因，其是由多基因、多步驟共同參與的過程。本實(shí)驗(yàn)旨在探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因親吻素-1(kisspeptin 1, KiSS-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)和微血管密度(microvessel density, MVD)(采用CD34標(biāo)記腫瘤血管而測定)在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中的表達(dá)及與預(yù)后關(guān)系，尋找一種可靠的能早期預(yù)測肺癌轉(zhuǎn)移和判斷預(yù)后的指標(biāo)，以期為臨床提供有效的診斷預(yù)測指標(biāo)和新的治療干預(yù)靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2008年1月～2013年5月河北省唐山市開灤總醫(yī)院診治的97例NSCLC患者，患者均經(jīng)手術(shù)、支氣管鏡等病理診斷確診，臨床資料完整，術(shù)前均未行放、化療及免疫治療；其中男性74例，女性23例；年齡42～80歲，中位年齡61歲；鱗癌53例，腺癌44例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者32例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者65例；腫瘤臨床分期采用國際抗癌協(xié)會(huì)1997年公布的NSCLC TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期18例，Ⅱ期33例，Ⅲ期30例，Ⅳ期16例。另選取同時(shí)期就診的20例肺良性病變患者作為對(duì)照組。NSCLC組和對(duì)照組均禁食10～20 h，于術(shù)前1天清晨及術(shù)后第10天清晨抽取肘靜脈血3 mL，3 000 r/min離心10 min，分離新鮮血清，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑 兔抗人單克隆抗體KiSS-1、MMP-2、CD34及ELISA試劑盒，均購自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法 采用ELISA法檢測97例NSCLC和20例肺良性病變患者血清中MMP-2的水平并嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作，加稀釋液于96孔板中，加樣，孵育2 h，緩沖液清洗，加MMP-2結(jié)合物，加底物，加終止液。檢測結(jié)果用酶標(biāo)儀測定。

1.3.2 免疫組化 將97例NSCLC和20例肺良性病變患者手術(shù)切除標(biāo)本石蠟包埋，常規(guī)脫蠟、水化，3%雙氧水，微波抗原修復(fù)，10%正常羊血清封閉；分別滴加1 ∶200的KiSS-1、MMP-2和CD34抗體，4 ℃過夜，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記兔抗人IgG，37 ℃孵育1 h，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，中性樹膠封固。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，取陽性對(duì)照片作為陽性對(duì)照。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) KiSS-1和MMP-2判定標(biāo)準(zhǔn)：KiSS-1胞質(zhì)呈棕黃色為陽性；MMP-2胞膜或胞質(zhì)呈棕黃色為陽性；采用陽性細(xì)胞百分比和著色強(qiáng)度進(jìn)行綜合判斷。(1)按陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分；(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相加：<3分為陰性，≥3分為陽性。

CD34陽性為血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)呈淺棕色至深棕色。MVD計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)(采用Weidner計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn))：先在顯微鏡低倍視野下找到3個(gè)微血管密集區(qū)，然后在高倍視野下計(jì)數(shù)CD34陽性的微血管數(shù)。同一張切片計(jì)數(shù)3個(gè)高倍視野，其結(jié)果取3次平均值。所有切片均采用雙盲法閱片。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC中KiSS-1、MMP-2和MVD的表達(dá) KiSS-1在對(duì)照組中均呈陽性，在NSCLC組中的陽性率為49.48%(48/97)。KiSS-1在NSCLC的Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)與Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型和分化程度無關(guān)。

最終建立了去皮減毒工藝相關(guān)系數(shù)模型的具體參數(shù)為：6張典型雷公藤去皮凈制完全的打粉樣本NIR光譜，取其平均作為參比光譜（take average as reference）；數(shù)據(jù)預(yù)處理方法（data preprocessing）二階導(dǎo)數(shù)，平滑點(diǎn)數(shù)設(shè)置為9；光譜范圍5800 cm-1～5500 cm-1，4400 cm-1～4200 cm-1；不排除 CO2區(qū)域；平均相關(guān)系數(shù) （average threshold）＞90%認(rèn)為凈制完全，去皮減毒工藝水平較好。

MMP-2在對(duì)照組中呈陰性，在NSCLC組中的陽性率為52.58%(51/97)。MMP-2在腫瘤直徑>3 cm、腺癌組、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)與腫瘤直徑≤3 cm、鱗癌組、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與患者性別、年齡、肺癌分化程度無關(guān)(P>0.05)。

CD34高表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞，周圍組織不著色。CD34標(biāo)記的血管數(shù)：20例對(duì)照組中微血管數(shù)為(24.90±10.46)條，實(shí)際范圍5～41條；97例NSCLC組中微血管數(shù)為(59.20±18.23)條，實(shí)際范圍19～109條。NSCLC組與對(duì)照組之間的MVD差異有顯著性(t=-11.500，P<0.01)，MVD在Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組數(shù)量高于Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組；與患者性別、年齡、腫瘤大小、病理類型和分化程度無關(guān)(表1，圖1～6)。

2.2 NSCLC中血清MMP-2的表達(dá) NSCLC術(shù)前組血清MMP-2表達(dá)水平[(530.83±57.21)ng/mL]顯著高于NSCLC術(shù)后組[(260.25±23.20)ng/mL]和對(duì)照組[(242.16±30.43)ng/mL](P<0.05)。NSCLC術(shù)后組血清MMP-2表達(dá)與對(duì)照組相比，差異無顯著性(P>0.05)。

MMP-2在腫瘤直徑>3 cm、肺腺癌組、Ⅲ+Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)與腫瘤直徑≤3 cm、肺鱗癌組、Ⅰ+Ⅱ期、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組相比，差異有顯著性(P<0.05)。MMP-2表達(dá)與患者性別、年齡、分化程度無關(guān)(P>0.05，表2)。

2.3 NSCLC中血清MMP-2水平與組織MMP-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性 NSCLC組織中MMP-2蛋白陽性者，其血清MMP-2水平高于MMP-2蛋白陰性者(P<0.05，表3)。

2.4 NSCLC組織中KiSS-1、MMP-2、MVD表達(dá)和術(shù)后生存率的關(guān)系 根據(jù)免疫組化表達(dá)結(jié)果將NSCLC組分為KiSS-1陰性組和KiSS-1陽性組，Kaplan-Meier生存曲線提示：KiSS-1陽性者術(shù)后5年生存率(9.28%)顯著高于陰性者(1.03%)(P<0.01)。

根據(jù)免疫組化結(jié)果將NSCLC組分為MMP-2陰性組和MMP-2陽性組，Kaplan-Meier生存曲線提示：MMP-2陽性者術(shù)后5年生存率(2.06%)顯著低于陰性者(8.25%)(P<0.01)。

①②③④⑤⑥

圖1 KiSS-1在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖2 KiSS-1在肺腺癌組織中呈陽性，SP法 圖3 MMP-2在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖4 MMP-2在肺腺癌組織中呈陽性，SP法 圖5 CD34在肺鱗癌組織中呈陽性，SP法 圖6 CD34在肺腺癌組織中呈陽性，SP法

圖7 KiSS-1(A)、MMP-2(B)和MVD(C)的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率的關(guān)系

表2 術(shù)前血清MMP-2水平與非小細(xì)胞肺癌臨床病理特征的關(guān)系

表3 非小細(xì)胞肺癌組織和血清中MMP-2表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞與宿主細(xì)胞之間多種分子和基因相互作用的結(jié)果，是多步驟參與的過程；其中突破基膜是轉(zhuǎn)移的首要環(huán)節(jié)。MMP-2作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員之一，能夠特異性的降解基膜和結(jié)締組織等細(xì)胞外間質(zhì)(Ⅳ型膠原和層黏蛋白)[2]，從而降低細(xì)胞之間的黏附作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移。焦娟等[3]研究表明，三陰型乳腺癌對(duì)MMP-2通路進(jìn)行活化，從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移的目的。以往的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本通常為一種組織，而本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法和ELISA法同時(shí)對(duì)癌組織和血清中MMP-2的水平進(jìn)行測定，并獲得一致性結(jié)果：NSCLC患者術(shù)前MMP-2的表達(dá)水平顯著高于肺良性病變患者和術(shù)后的表達(dá)水平(P<0.05)；MMP-2表達(dá)與腫瘤大小、病理類型、TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這與Ali等[4]把血清MMP-2水平作為評(píng)價(jià)腫瘤惡性程度的有效指標(biāo)觀點(diǎn)相符。本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法聯(lián)合檢測提高了實(shí)驗(yàn)結(jié)論的準(zhǔn)確性及可信度，且外周血取材簡便易行，更易推廣應(yīng)用。

表4 KiSS-1、MMP-2、MVD表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌患者5年生存率的關(guān)系

閆鐵夫等[5]的研究結(jié)果表明，腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移需要大量新生血管的形成。CD34是與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白，常作為腫瘤MVD的標(biāo)志物，目前已將MVD作為評(píng)估腫瘤血管形成的重要標(biāo)準(zhǔn)[6]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化法計(jì)數(shù)20例對(duì)照組肺組織和97例NSCLC患者的微血管數(shù)量，結(jié)果顯示：NSCLC組與對(duì)照組之間的MVD差異有顯著性(P<0.01)，且MVD與腫瘤TNM分期和淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.01)。進(jìn)一步分析與5年生存率的關(guān)系，結(jié)果顯示：微血管數(shù)高組肺癌患者術(shù)后5年生存率(4.12%)顯著低于低組(6.19%)(P<0.01)。上述結(jié)果提示微血管計(jì)數(shù)有助于判斷患者的預(yù)后情況，與唐智等[7]認(rèn)為微血管數(shù)可以用來評(píng)估鼻腔(竇)鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后的結(jié)論相符。

王洪興等[8-9]的研究結(jié)果表明KiSS-1對(duì)胃癌細(xì)胞株的侵襲和轉(zhuǎn)移有明顯抑制作用。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)分化良好、腫瘤體積小、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的膽囊癌KiSS-1的表達(dá)顯著高于分化差、腫瘤體積大、并伴浸潤和轉(zhuǎn)移的膽囊癌。KiSS-1在肺癌中的表達(dá)，尤其是與患者術(shù)后生存期的關(guān)系，國內(nèi)外較少報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：KiSS-1表達(dá)與NSCLC臨床TNM分期、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。對(duì)NSCLC患者進(jìn)行5年生存期分析發(fā)現(xiàn)，KiSS-1陽性者術(shù)后5年生存率(9.28%)顯著高于陰性者(1.03%)(P<0.01)。

綜上所述，KiSS-1、MMP-2和MVD與NSCLC的轉(zhuǎn)移和預(yù)后密切相關(guān)，三者可作為腫瘤惡性程度的評(píng)判指標(biāo)和基因治療的靶點(diǎn)，并對(duì)患者生存期的預(yù)測提供一定的幫助。