肝癌組織中PKM2表達(dá)及與放療敏感性的關(guān)系

馬 歡，蘆東徽，徐 濱，徐明靜，胡 勇，潘躍銀

肝癌是臨床上最為常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年全球有62.6萬(wàn)以上的新發(fā)肝癌病例，發(fā)病率位居惡性腫瘤的第5位，病死率位居第3位[1]。近年來(lái)，我國(guó)肝癌的發(fā)病率呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前每年約有35萬(wàn)新發(fā)肝癌病例，且病死率高[2]。三維適形放療是肝癌患者臨床常用的治療措施，其療效與患者對(duì)放療的敏感性緊密相連。M2型丙酮酸激酶(M2 pyruvate kinase, PKM2)主要位于細(xì)胞質(zhì)，在腫瘤細(xì)胞中該蛋白的表達(dá)水平較高，可參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]。有研究證實(shí)[4]，肝癌組織中PKM2蛋白表達(dá)與患者預(yù)后密切相關(guān)，但該蛋白表達(dá)與放療敏感性關(guān)系的文獻(xiàn)鮮有報(bào)道。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)收集80例肝癌患者的臨床資料，旨在探討肝癌組織中PKM2表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2012年2月～2018年10月中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院腫瘤科診治的80例肝癌患者。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)均行肝臟穿刺活檢術(shù)且均病理檢查證實(shí)為肝癌；(2)均實(shí)施三維適形放療；(3)均未接受其它種類(lèi)抗腫瘤治療；(4)均有完整的臨床資料；排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性肝臟惡性腫瘤者；(2)伴有重要臟器功能障礙者；(3)合并精神障礙者；(4)合并認(rèn)知障礙或溝通障礙者；(5)存在嚴(yán)重外傷者。80例中男性45例，女性35例，年齡41～76歲，平均(56.96±6.82)歲，臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期22例、Ⅲ期36例、Ⅳ期16例。分化程度參照Edmondson-Steiner分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，低分化(近似來(lái)源組織的不成熟形態(tài))21例、中分化(分化程度低，但明確保留起源組織的特點(diǎn))30例、高分化(分化程度高，接近來(lái)源組織的成熟形態(tài))29例。本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第901醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測(cè)肝癌組織中PKM2蛋白表達(dá) 染色步驟：常規(guī)脫蠟、水合、切片、固定、水化，抗原熱修復(fù)，滴加一抗，劑量為50～100 μL，4 ℃孵育過(guò)夜，以PBS緩沖液沖洗后滴加通用型鼠/兔聚合物，劑量為50 μL，37 ℃濕盒孵育20 min，顯色。以蘇木精復(fù)染，加入鹽酸分化，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。脫水后封固，在鏡下觀(guān)察組織中蛋白表達(dá)，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕色或棕黃色染色為蛋白陽(yáng)性，將蛋白陽(yáng)性率>10%者記為陽(yáng)性。

1.2.2 三維適形放療法 采用CT掃描，層厚和層距均設(shè)置3.0 mm。將掃描結(jié)果傳輸至三維適形治療計(jì)劃系統(tǒng)，勾畫(huà)靶區(qū)，觀(guān)察圖像并確認(rèn)腫瘤體積后輸入數(shù)據(jù)，計(jì)劃靶體積為腫瘤體積外放1.0～1.5 cm。使用直線(xiàn)加速器15MV-X射線(xiàn)照射，每次劑量為2 Gy，每天1次，每周5次，總照射劑量為60 Gy。

1.3 觀(guān)察指標(biāo) (1)統(tǒng)計(jì)本組患者肝癌組織中PKM2蛋白的表達(dá)。(2)對(duì)比不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療前后血清AFP水平差異，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)。(3)對(duì)比不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療效果，參照實(shí)體瘤療效判定標(biāo)準(zhǔn)，完全緩解、部分緩解者均記為放療敏感；穩(wěn)定、進(jìn)展者均記為放療不敏感，且完全緩解與部分緩解例數(shù)總和構(gòu)成比為緩解率。(4)分析PKM2蛋白表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)描述，等級(jí)分布比較以秩和檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析探討PKM2蛋白表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織中PKM2蛋白的表達(dá) 80例肝癌組織中PKM2蛋白陰性10例，陽(yáng)性70例，陽(yáng)性率為87.50%(70/80)(圖1～4)。

①②③④

圖1 肝癌(Ⅲ期)組織中PKM2蛋白陰性，EliVision法 圖2 肝癌(Ⅳ期)組織中PKM2蛋白弱陽(yáng)性，EliVision法 圖3 肝癌(Ⅱ期)組織中PKM2蛋白中等陽(yáng)性，EliVision法 圖4 肝癌(Ⅳ期)組織中PKM2蛋白強(qiáng)陽(yáng)性，EliVision法

2.2 不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療前后血清AFP水平 放療前后肝癌組織PKM2蛋白陽(yáng)性者血清AFP水平均高于陰性者(P<0.05)，且放療后血清AFP水平均低于放療前(P<0.05，表1)。

表1 不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療前后血清AFP水平

2.3 不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療效果 PKM2蛋白陽(yáng)性者放療效果等級(jí)分布與陰性者對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=6.783，P=0.009)，且PKM2蛋白陽(yáng)性者緩解率(放療敏感率)明顯低于陰性者(χ2=6.445，P=0.011，表2)。

2.4 PKM2蛋白表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系 放療不敏感患者臨床分期、分化程度、PKM2蛋白表達(dá)與放療敏感者對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，表3)，且均是放療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05，表4)。

表3 放療敏感患者與不敏感患者可能因素的構(gòu)成比[n(%)]

表4 Logistic回歸分析

3 討論

研究表明[5]，除病理特征可能會(huì)影響肝癌患者放療敏感性外，細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控相關(guān)基因也是此類(lèi)患者放療敏感性的重要影響因素。另有研究表明[6]，肝癌組織中PKM2蛋白表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且其表達(dá)水平也可影響惡性腫瘤細(xì)胞的增殖及腫瘤生長(zhǎng)。

表2 不同PKM2蛋白表達(dá)患者放療效果[n(%)]

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肝癌組織中PKM2蛋白陽(yáng)性率為87.50%，呈高表達(dá)，與Yang等[7]的報(bào)道相符。另外，PKM2蛋白陽(yáng)性者放療前血清AFP水平高于陰性者，放療后均下降，且放療后前者仍高于后者，可知PKM2蛋白陽(yáng)性者血清AFP水平高，雖經(jīng)化療可控制血清AFP水平，但化療后相較于PKM2蛋白陰性者，陽(yáng)性者血清AFP水平仍較高。血清AFP是原發(fā)性肝癌常見(jiàn)的腫瘤標(biāo)志物之一，與臨床分期密切相關(guān)，且其水平越高，患者預(yù)后越差。PKM2蛋白是腫瘤組織有氧酵解過(guò)程中的關(guān)鍵酶，其表達(dá)水平越高，糖酵解代謝為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖提供的能量越多，腫瘤細(xì)胞快速分裂和增殖的物質(zhì)基礎(chǔ)也越多[8]。在肝癌患者中應(yīng)當(dāng)積極控制PKM2蛋白的表達(dá)水平，控制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的能量、原料供應(yīng)。

此外，本實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中PKM2蛋白陽(yáng)性者緩解率(放療敏感率)明顯低于陰性者，可知肝癌組織中PKM2蛋白陽(yáng)性者放療不敏感的可能性大，放療效果不甚理想。探討PKM2蛋白表達(dá)與放療敏感性的關(guān)系，結(jié)果顯示臨床分期Ⅲ期、臨床分期Ⅳ期、低分化、PKM2蛋白陽(yáng)性均是放療不敏感的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=3.274、5.328、5.942、7.135，P<0.05)，可知上述因素均可影響放療敏感性，導(dǎo)致療效不理想。既往有報(bào)道證實(shí)[9]，臨床分期Ⅲ期、臨床分期Ⅳ期、低分化均可影響放療敏感性，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，原因可能為：臨床分期越高，患者病情越嚴(yán)重，且體質(zhì)越差，可能影響放療敏感性；分化越低，肝癌的惡性程度越高，疾病進(jìn)展越快，因而放療敏感性越差。此外，推測(cè)PKM2蛋白表達(dá)越高，為惡性腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的能量、原料供應(yīng)量越充足，因而放射線(xiàn)殺滅惡性腫瘤細(xì)胞的難度越大，放療不敏感的風(fēng)險(xiǎn)也越高。因此，在臨床實(shí)踐中應(yīng)積極控制PKM2蛋白的表達(dá)，尤其是對(duì)于低分化的肝癌患者應(yīng)加強(qiáng)重視，合理采用輔助治療措施方可達(dá)到理想效果。

綜上所述，在肝癌組織中PKM2蛋白表達(dá)水平高，與血清AFP水平、放療效果緊密相聯(lián)，且PKM2蛋白陽(yáng)性等均是影響放療敏感性的危險(xiǎn)因素，針對(duì)上述因素均應(yīng)積極防控，以提升放療效果，改善患者預(yù)后。