冷凍與石蠟?zāi)I活檢標本中PLA2R1表達的臨床診斷意義比較

劉瓊?cè)?，廖悅?cè)A，軒慧杰，鄭明珠，李榮崗，鄭 焱，周 偉，張 鑫,

腎病綜合征是臨床常見的慢性腎病，嚴重影響患者的健康及生活[1]。有研究顯示，腎病活檢中前5位的病變類型：IgA腎病(IgA nephropathy, IgA-N)占28.1%、特發(fā)性/原發(fā)性膜性腎病(idiopathic/primary membranous nephropathy, IMN)占23.4%、微小病變腎病(minimal change disease, MCD)占17.1%、繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy, SMN)占10.8%和局灶性節(jié)段性腎小球硬化(focal/segmental glomerulosclerosis, FSGS)占5.5%[2]。臨床診斷中部分SMN的原發(fā)病情隱匿，與IMN的臨床表現(xiàn)較難鑒別，但兩者治療策略和預(yù)后不同[3]，因此開發(fā)有效穩(wěn)定的新鑒別診斷策略有重要的臨床意義?，F(xiàn)已明確，IMN患者足細胞表面表達磷脂酶A2受體1(phospholipase A2 receptor 1, PLA2R1)及體內(nèi)的抗PLA2R1抗體的增多是導(dǎo)致IMN的重要發(fā)病機制之一[4]，但PLA2R1在腎病活檢組織中的表達報道較少，檢測方法也尚未統(tǒng)一。因此，本文收集1 000例腎病活檢石蠟組織和215例冷凍組織，采用免疫組化法及免疫熒光技術(shù)檢測PLA2R1的表達，比較兩種方法的優(yōu)劣，并分析PLA2R1在全類型腎病活檢組織中的表達。

1 材料與方法

1.1 標本 收集2013年1月～2019年2月江門市中心醫(yī)院行腎臟活檢的患者標本及臨床資料，臨床表現(xiàn)以腎病綜合征為主，有明確腎臟病理診斷。根據(jù)文獻報道[2]將本組1 000例腎病患者分為6大類：IMN、SMN、IgA-N、MCD、FSGS和其他。在1 000例腎活檢標本中，其中2018年5月～2019年2月的215例患者同時有冷凍標本和石蠟標本；2013年1月～2018年4月的785例患者只有石蠟標本。

1.2 材料 磷酸鹽緩沖液(PBS)、胃蛋白酶消化液、檸檬酸鹽修復(fù)液(pH 6.0)、乙二胺四乙酸(EDTA)修復(fù)液(pH 8.0)、三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)修復(fù)液(pH 9.5)及抗體稀釋液，購自北京中杉金橋公司；抗PLA2R1的兔多克隆抗體，購自美國Sigma Aldrich公司；偶聯(lián)熒光染料Alexa Fluor 488的羊抗兔二抗，購自美國Cell Signal Technology公司；含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗熒光猝滅封片液，購自上海碧云天公司；免疫組化DAB染色系統(tǒng)，購自美國Ventana公司；ULTRA全自動免疫組化染色儀，購自美國Bench Mark公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍標本的免疫熒光染色 冷凍的腎臟穿刺活檢標本經(jīng)4 μm厚切片，丙酮中-20 ℃固定10 min；含0.5% Tween-20的磷酸鹽緩沖液含吐溫(PBST)浸洗后PLA2R1抗體工作液(1 ∶800)4 ℃孵育過夜；PBST浸洗后二抗工作液(1 ∶1 000)避光37 ℃孵育30 min；PBST浸洗后DAPI抗熒光猝滅封片液封固，熒光顯微鏡觀察，細胞核染料DAPI為藍光通道，針對PLA2R1的免疫熒光顯色染料Alexa Fluor 488為綠光通道。

判讀標準[5]：腎小球發(fā)出熒光判為目標熒光，腎小管等間質(zhì)組織著色為背景熒光：(1)高倍鏡下腎小球與背景顯示同等的弱亮度為(-)；(2)高倍鏡下腎小球比背景更為明亮，但未見細顆粒熒光物為(-/+)；(3)高倍鏡下腎小球有細顆粒熒光物，但背景依然有可識別的亮度為(+)；(4)高倍鏡下見腎小球有粗顆粒熒光物，而幾乎不見背景信號為()；(5)高倍鏡下僅見耀眼的腎小球部信號，有彌漫性熒光物聚集為()。其中，將(-～-/+)定義為陰性，將(+～/)定義為陽性。

1.3.2 石蠟標本的免疫組化染色 石蠟包埋的腎臟穿刺活檢標本2 μm厚切片，烤片、脫蠟、水化。滴加胃蛋白酶消化液，37 ℃孵育20 min，修復(fù)結(jié)束后洗凈切片，置全自動免疫組化染色機中，按流程完成抗體的孵育及DAB的顯色過程，關(guān)鍵參數(shù)：一抗(1 ∶800稀釋)37 ℃孵育44 min、二抗37 ℃孵育32 min、DAB室溫顯色8 min。顯色完成后，洗凈、復(fù)染核、脫水、封固，鏡下觀察。在預(yù)實驗中，選取100例石蠟組織標本(IMN選40例，其余病理類型各12例)，進行4種修復(fù)條件及2種切片厚度(2 μm或4 μm)的比較。胃蛋白酶消化修復(fù)條件：滴加胃蛋白酶消化液，37 ℃孵育20 min；檸檬酸鹽、EDTA及Tris-EDTA修復(fù)液的修復(fù)條件：高壓鍋水浴高壓熱處理10 min。

判讀標準[5]：腎小球呈棕黃色或棕黑色為目標著色，且要求全片80%腎小球的陽性形態(tài)一致，腎小管等間質(zhì)組織著色為背景著色，且僅允許背景呈淡黃色。在單個腎小球中：(1)未著色或淡黃色著色區(qū)域>90%為(-)；(2)有棕黃色的細絲狀或細顆粒狀著色，但著色區(qū)域未超過50%為(-/+)；(3)>50%的區(qū)域呈棕黃色的細絲狀或細顆粒狀著色，或有棕黑色粗顆粒樣著色，但著色區(qū)域未超過30%為(+)；(4)有棕黑色粗顆粒樣著色，著色區(qū)域超過30%，但未呈彌散分布為()；(5)腎小球區(qū)域彌散分布棕黑色粗顆粒樣著色為()；并將(-～-/+)定義為陰性，將(+～/)定義為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料用頻數(shù)表示，用Excel 2010及GraphPad Prism 5.0軟件處理數(shù)據(jù)，各組間頻數(shù)數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用χ2檢驗或Fisher精確檢驗，檢驗水平α=0.05。其中，靈敏度為檢測指標的真陽性例數(shù)占該病理分類總?cè)藬?shù)的百分率，即正確判斷為非該病理分類的百分率；誤診率為檢測指標的假陽性例數(shù)占非該病理分類總?cè)藬?shù)的百分率，即錯誤判斷為該病理分類的百分率。

2 結(jié)果

2.1 腎病綜合征患者的臨床病理特征 分析冷凍標本的免疫熒光染色和石蠟標本的免疫組化染色的患者性別、年齡、病理分類及臨床分期的關(guān)系，結(jié)果顯示兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 腎病綜合征患者的臨床病理特征[n(%)]

IMN.特發(fā)性/原發(fā)性膜性腎??；SMN.繼發(fā)性膜性腎病；MCD.微小病變腎?。籉SGS.局灶性節(jié)段性腎小球硬化；IgA-N.IgA腎病

2.2 免疫組化檢測石蠟標本的PLA2R1表達條件優(yōu)化 比較4種修復(fù)方法對PLA2R1的石蠟標本的免疫組化染色影響，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)胃酶消化修復(fù)的染色效果最好：目標著色部位的顏色和顆粒粗細均勻，背景著色低。進一步比較2 μm切片和4 μm切片對PLA2R1石蠟標本的免疫組化染色，預(yù)實驗結(jié)果顯示，2 μm切片能降低PLA2R1在非IMN類病理組織的陽性率(16.7%)，但對IMN陽性率的影響較小(77.5%)，故后續(xù)實驗選擇2 μm切片加胃酶消化修復(fù)，用于本組1 000例石蠟標本的免疫組化染色。

2.3 兩種染色方法中PLA2R1表達比較 PLA2R1在冷凍標本的免疫熒光染色實驗中總陽性率為19.1%；在石蠟標本的免疫組化染色實驗中為32.9%，兩組在各項指標的分布差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表2)。

2.4 PLA2R1表達與腎病綜合征臨床病理特征的關(guān)系 冷凍標本的免疫熒光染色和石蠟標本的免疫組化染色中PLA2R1的陽性與病理分類相關(guān)，均在IMN中高表達，但兩者表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表3)。在IMN中，冷凍標本的免疫熒光染色陽性率為72.0%，石蠟標本的免疫組化染色為79.8%；但石蠟標本的免疫組化染色在非IMN的陽性率約為20%，高于冷凍標本的免疫熒光染色在非IMN類型的陽性率約為5%(表3，圖1)。此外，冷凍標本的免疫熒光染色判斷IMN患者的敏感度為72.0%，誤診率為3.0%；石蠟標本的免疫組化染色判斷IMN患者的敏感度為79.8%，誤診率為19.4%。

表2 兩種染色方法中PLA2R1表達比較[n(%)]

GCW.腎小球毛細血管壁；MS.系膜區(qū)；GW.腎小球壁；FS.硬化灶

表3 兩種方法檢測PLA2R1表達與腎病綜合征患者臨床病理特征的關(guān)系[n(%)]

IMN.特發(fā)性/原發(fā)性膜性腎??；SMN.繼發(fā)性膜性腎??；MCD.微小病變腎病；FSGS.局灶性節(jié)段性腎小球硬化；IgA-N.IgA腎病

ABCDEFG

圖1 PLA2R1在不同病理類型中的染色：A.特發(fā)性/原發(fā)性膜性腎病冷凍標本的免疫熒光染色；B.特發(fā)性/原發(fā)性膜性腎病石蠟標本的免疫組化染色；C.繼發(fā)性膜性腎病石蠟標本的免疫組化染色；D.微小病變腎病石蠟標本的免疫組化染色；E.局灶性節(jié)段性腎小球硬化石蠟標本的免疫組化染色；F.IgA腎病石蠟標本的免疫組化染色；G.其他腎病石蠟標本的免疫組化染色

3 討論

本組經(jīng)冷凍標本的免疫熒光染色法檢測PLA2R1在IMN中的陽性率為72.0%，非IMN陽性率為3.0%；綜合國內(nèi)外文獻報道，一般認為PLA2R1在IMN類患者腎活檢組織中的陽性率為50%～100%，在非IMN類則小于10%[5-9]，本組中冷凍標本的免疫熒光染色結(jié)果與之相似。文獻報道冷凍標本的免疫熒光染色、石蠟標本的免疫組化染色和石蠟標本的免疫熒光染色三種方法，均可用于檢測腎組織中PLA2R1表達，而切片厚度和修復(fù)條件影響其染色結(jié)果[5-9]；經(jīng)預(yù)實驗的參數(shù)優(yōu)化，本組在薄切片(2 μm)及胃酶修復(fù)石蠟標本的免疫組化染色條件下，PLA2R1在IMN中的陽性率為79.8%，在非IMN中的陽性率為19.4%，與文獻報道接近。PLA2R1在IMN中石蠟標本的免疫組化染色敏感度稍高于冷凍標本的免疫熒光染色(72.0%和79.8%)，但石蠟標本的免疫組化染色誤診率遠高于冷凍標本的免疫熒光染色(19.4%和3.0%)，表明修復(fù)過程可能增加PLA2R1的假陽性率，冷凍標本的診斷價值可能高于石蠟標本。

Pan等[10]報道在IMN中體外培養(yǎng)的人足細胞表達PLA2R1，且血清中IB組分泌磷脂酶A2(sPLA2 IB)通過激活PLA2R1增加足細胞中花生四烯酸含量，進而引起凋亡。有文獻報道[11]，人足細胞PLA2R1胞外段能與Annexin A2及S100A10結(jié)合，進一步組成巨大分子量的復(fù)合物，參與跨膜信號的傳導(dǎo)，而抗PLA2R1抗體能破壞復(fù)合物的相互作用。利用人類蛋白質(zhì)圖譜數(shù)據(jù)庫(http://www.proteinatlas.org/ENSG00000153246-PLA2R1/tissue)記錄PLA2R1的免疫組化染色圖像，能明確觀察PLA2R1在6例正常人的腎小球組織中呈強陽性。

綜上所述，本實驗推測PLA2R1有可能在腎小球細胞中表達，并與Annexin A2等細胞膜蛋白形成巨型復(fù)合物，產(chǎn)生抗原決定簇的遮蔽作用。未經(jīng)抗原修復(fù)的冷凍標本的免疫熒光染色中，大部分非IMN組織無法檢測到PLA2R1，而部分IMN患者因存在抗PLA2R1抗體，破壞PLA2R1復(fù)合物結(jié)構(gòu)，使PLA2R1抗原決定簇暴露而被檢測到。然而，石蠟標本的免疫組化染色的抗原修復(fù)過程，能使巨型復(fù)合物中PLA2R1的抗原決定簇直接暴露，故大部分腎小球均能檢測出PLA2R1的表達。

雖然冷凍標本的免疫熒光染色檢測腎活檢組織中PLA2R1的表達具有臨床診斷意義，但手工免疫熒光染色的操作流程依然粗糙，結(jié)果判讀也易被環(huán)境影響，所以本組致力于石蠟標本的免疫組化染色檢測PLA2R1的可行性分析，希望后續(xù)研究結(jié)果能對腎臟臨床病理技術(shù)的發(fā)展提供幫助。