喉鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系

郭林芝，王 麗，曹紅艷，劉青華，閆玲艷，菅曉婷，吳月琴，李靈敏

喉鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一[1]，治療主要包括手術(shù)、放療和化療，由于腫瘤具有較強(qiáng)的侵襲性和轉(zhuǎn)移能力，患者術(shù)后生存率低，預(yù)后較差[2]。尋找與喉鱗狀細(xì)胞癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)，不僅有助于判斷預(yù)后，而且可以為喉鱗狀細(xì)胞癌生物學(xué)治療靶點(diǎn)的選擇提供依據(jù)。ZNF750是ZNF家族中的一員，含有典型的C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域。ZNF750基因編碼的蛋白，通常在復(fù)層扁平上皮細(xì)胞中表達(dá)，是上皮細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子，對增殖相關(guān)基因及分化相關(guān)基因分別起抑制及促進(jìn)作用[3]。有研究顯示其與食管癌等多種腫瘤的發(fā)病及預(yù)后密切相關(guān)，Lawrence等[4]對腫瘤組學(xué)測序數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750的突變顯著；Zhang等[5-6]證實(shí)食管鱗狀細(xì)胞癌和口腔鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750是一種腫瘤抑制基因；低表達(dá)ZNF750的食管鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后較差[7]；高表達(dá)ZNF750的食管鱗狀細(xì)胞癌患者對放、化療的敏感性高[8]。目前，ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)功能尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)檢測ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)，探討其與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的關(guān)系及意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集2009年1月～2012年1月山西省腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的115例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和56例癌旁正常喉組織標(biāo)本；另收集6對新鮮喉鱗狀細(xì)胞癌組織及配對癌旁正常喉組織。所有患者均有完整的臨床資料，術(shù)前均未接受放、化療，且術(shù)后病理切片均由病理科兩位以上病理醫(yī)師確診為喉鱗狀細(xì)胞癌。電話隨訪患者每3個月1次，隨訪日期從手術(shù)日期開始到患者死亡或術(shù)后5年止。

1.2 主要試劑 兔多克隆抗ZNF750抗體購自Proteintech公司，即用型快捷免疫組化EnVision試劑盒購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測ZNF750的表達(dá) 115例喉鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本和56例癌旁正常喉組織標(biāo)本，均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3%H2O2室溫孵育10 min，枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.0)高壓修復(fù)2 min，晾至室溫，10%BSA室溫封閉20 min，滴加ZNF750抗體(1 ∶200)，4 ℃冰箱過夜。滴加二抗37 ℃ 40 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封固；鏡下觀察、拍照。

1.3.2 Western blot法檢測ZNF750的表達(dá) 將6對新鮮喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常喉組織研碎加入細(xì)胞溶解液提取蛋白。用BCA蛋白試劑盒檢測提取的組織溶液蛋白濃度，將等量的總蛋白進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，然后用脫脂奶粉封閉，洗膜后放入抗ZNF750抗體(1 ∶500)溶液中，4 ℃搖床過夜。洗膜后放入二抗中孵育，再洗膜，顯影。顯影后的膠片用Image J軟件掃描分析。

1.4 結(jié)果判讀 ZNF750蛋白陽性信號定位于細(xì)胞核，根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無著色為0分、弱著色為1分、中等著色為2分、強(qiáng)著色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分：0～29%為1分、30%～59%為2分、>60%為3分。兩者得分相加：≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。每張切片分別取5個不同視野進(jìn)行觀察后取平均值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、Kaplan-Meier生存曲線及Cox比例風(fēng)險回歸模型對ZNF750蛋白表達(dá)、臨床病理特征、總生存期、預(yù)后因子的單-多因素分析進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 喉鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750的表達(dá) 采用Western blot法檢測6對新鮮喉鱗狀細(xì)胞癌組織及癌旁正常喉組織中的ZNF750蛋白，結(jié)果顯示ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的蛋白水平明顯低于癌旁正常喉組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)；免疫組化法檢測115例喉鱗狀細(xì)胞癌組織及56例癌旁正常喉組織石蠟切片，結(jié)果顯示：ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常喉組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖1 Western blot法檢測喉鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁正常喉組織中ZNF750的表達(dá)

2.2 喉鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性 ZNF750低表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)；ZNF750低表達(dá)與患者性別、年齡、吸煙、飲酒及分化程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。

2.3 喉鱗狀細(xì)胞癌中ZNF750表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系 Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明，ZNF750低表達(dá)患者的總生存率低于高表達(dá)患者(P<0.05，圖3)，高表達(dá)患者5年生存率為78.0%，低表達(dá)患者5年生存率為47.3%。單因素分析表明，腫瘤TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ZNF750低表達(dá)是影響患者預(yù)后的重要因素(P<0.05)。多因素分析表明，ZNF750低表達(dá)是喉鱗狀細(xì)胞癌患者獨(dú)立的預(yù)后因子(P<0.05，表2)。

AB

圖2 ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌組織(A)和癌旁正常喉組織中(B)的表達(dá)，EnVision兩步法

表1 ZNF750表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性

圖3 喉鱗狀細(xì)胞癌ZNF750低表達(dá)和高表達(dá)患者的生存曲線

表2 喉鱗狀細(xì)胞癌臨床特征與總生存期的單因素與多因素分析

3 討論

ZNF750基因定位于17q25.3，是編碼723個氨基酸的蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于復(fù)層扁平上皮組織，是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成細(xì)胞的終末分化。

文獻(xiàn)報道，與正常組織相比ZNF750的表達(dá)水平在鱗狀細(xì)胞癌患者中明顯降低[9]，ZNF750突變與上皮來源的惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。ZNF750在鱗狀細(xì)胞癌中常發(fā)生突變，突變點(diǎn)主要位于C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域，提示鋅指結(jié)構(gòu)域在介導(dǎo)ZNF750的抑癌活性中起重要作用[3]。ZNF750通過C2H2鋅指結(jié)構(gòu)域與靶基因作用，抑制增殖相關(guān)基因(RBBP8、HOMER3)的表達(dá)，激活分化基因(PPL、PKP1)的表達(dá)[10]。本實(shí)驗(yàn)通過Western blot法和免疫組化法對喉鱗狀細(xì)胞癌和癌旁正常喉組織中ZNF750蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示：ZNF750在喉鱗狀細(xì)胞癌組織中的蛋白水平明顯低于癌旁正常喉組織，提示ZNF750蛋白表達(dá)減少與喉鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)。目前，ZNF750缺失導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的機(jī)制尚不明確。有研究顯示，ZNF750作為一種轉(zhuǎn)錄因子，與靶基因RCOR1和CTBP1/2相互作用，抑制增殖相關(guān)基因的表達(dá)；與靶基因RCOR1、KLF4和CTBP1/2相互作用，激活分化基因的表達(dá)[10]。因此，當(dāng)ZNF750突變后，無法抑制細(xì)胞過度增殖，同時細(xì)胞分化受損可能是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的原因之一。

本實(shí)驗(yàn)對ZNF750表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，ZNF750低表達(dá)與臨床TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)。生存分析結(jié)果顯示，ZNF750低表達(dá)是喉鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立的危險因素，ZNF750低表達(dá)患者的總生存率低于高表達(dá)患者。以上結(jié)果提示，ZNF750低表達(dá)與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與Otsuka等[7]的研究結(jié)果一致，可能是ZNF750調(diào)節(jié)一組參與細(xì)胞遷移、增殖和黏附的基因，特別是ZNF750直接誘導(dǎo)長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達(dá)，lncRNA影響細(xì)胞的增殖、周期、凋亡等，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[11]；并抑制LAMC2的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的增殖和遷移[12]。

總之，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示喉鱗狀細(xì)胞癌組織中ZNF750表達(dá)明顯減少，ZNF750低表達(dá)與喉鱗狀細(xì)胞癌TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)；提示ZNF750可能是一種新的預(yù)后生物標(biāo)志物，對其調(diào)控可能成為喉鱗狀細(xì)胞癌生物治療的重要靶點(diǎn)之一。