淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥14例臨床病理分析

張會超，王芃堉，丁雅雯，李 宏，宋 媛，高社軍，李清靖，黃 晨，劉麗宏

淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥(lymphoplasmacytic lymphoma/Waldenstr?m’s macroglobulinemia, LPL/WM)是一種少見的惰性成熟小B細胞淋巴瘤，在非霍奇金淋巴瘤中占比不足2%。LPL/WM是由小B淋巴細胞、漿細胞樣淋巴細胞和漿細胞組成的淋巴瘤，常常侵犯骨髓，也可侵犯淋巴結(jié)和脾臟，并且不符合其他伴漿細胞分化的小B細胞淋巴瘤診斷標準。LPL侵犯骨髓同時伴有血清單克隆性IgM丙種球蛋白時診斷為WM。90%～95%的LPL為WM，僅小部分LPL患者分泌單克隆性IgA、IgG成分或不分泌單抗隆性免疫球蛋白[1]。LPL/WM缺乏與其他伴有漿細胞分化的成熟小B細胞淋巴瘤鑒別的特異性形態(tài)學、免疫表型、基因及臨床特征。因此，本文回顧性分析14例LPL/WM的臨床資料及各項實驗室檢查，探討其與伴漿細胞分化的小B細胞淋巴瘤的不同特點，提高臨床和病理醫(yī)師的診斷與鑒別診斷水平。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2010年6月～2019年7月河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院診治的13例LPL/WM患者及1例LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)。所有患者均符合LPL/WM的診斷標準，臨床資料包括：病史、體檢、各項實驗室檢查及影像學檢查等。

1.2 方法

1.2.1 細胞形態(tài)學檢查 于患者髂后上棘行骨髓穿刺，穿刺過程中避免骨髓穿刺液被血液稀釋，選2塊小粒較多、厚薄均勻的骨髓片，經(jīng)瑞氏染色，油鏡觀察骨髓造血細胞及其它細胞形態(tài)。

1.2.2 流式細胞學檢查 流式細胞儀為Beckman Coulter公司的Navios，Alexa Flour 488 nm、Alexa Flour 647 nm、Alexa Flour 700 nm激發(fā)光源，十色。單抗試劑均購自美國Beckman Coulter公司。采用Kaluza軟件分析數(shù)據(jù)，設陰性對照，結(jié)果判斷以細胞抗原表達>陰性對照20%以上為陽性。取骨髓血細胞經(jīng)淋巴細胞分層液處理后，調(diào)整細胞數(shù)為每毫升1×106個細胞，置于PBS液中待用，單細胞懸液中加入單抗：CD20、CD19、CD22、sIgM、CD5、CD23、Kappa、Lambda、CD10、CD38、CD138、CD56、CD45、IgM。4 ℃暗處孵育，PBS洗浴3次，12 h內(nèi)待檢。

1.2.3 MYD88 L265P突變檢測 14例標本均來自WM患者的骨髓病變組織，新鮮骨髓標本經(jīng)CD19單抗磁珠分選，從CD19陽性細胞中提取DNA。采用RT-PCR法[3]檢測MYD88 L265P突變。MYD88檢測陽性標準為野生型與突變型CT值差值小于8即為陽性，差值大于10即為陰性，介于兩者之間需進行復查，再根據(jù)臨床情況進行綜合判斷。

1.2.4 淋巴結(jié)活檢病理 標本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚切片，HE染色，光鏡觀察。免疫組化染色采用EliVision兩步法，高壓煮沸抗原修復，一抗包括CD20、CD30、CD23、CD21、CD10、CD5、Ki-67、κ、λ、MUM1、CD38、CD138、CD21及二、三抗均購自福州邁新公司。DAB染色，HE復染。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征 14例患者中男性11例，女性3例，發(fā)病年齡45～82歲，平均60歲，中位年齡59歲；肝脾(包括肝或脾)腫大者12例，淋巴結(jié)腫大者11例，高粘滯血癥者8例，14例患者均有M蛋白水平，中位水平為48.0 g/L；IgMκ型13例，IgMλ型1例，MYD88 L256P突變14例(表1)。實驗室檢查結(jié)果顯示：14例WM患者中外周血淋巴細胞百分比升高者占6例，血紅蛋白減低者13例，血小板計數(shù)減低者6例，乳酸脫氫酶升高者2例，β2微球蛋白升高者9例，肌酐增高者1例，尿素氮升高者1例，抗人球蛋白試驗陽性者3例，乙肝陽性者2例(表2)。

表1 13例LPL/WM及1例LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤的臨床資料

*LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤；LPL/WM.淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥

表2 13例LPL/WM及1例LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤患者的實驗室檢查

*LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤；LPL/WM.淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥

2.2 骨髓細胞形態(tài)學特征 14例LPL/WM患者的造血細胞均有不同程度的受抑，成熟紅細胞呈明顯緡錢狀排列，有核細胞以小淋巴細胞、漿樣淋巴細胞、漿細胞為主，另可見不同比例的肥大細胞；小淋巴細胞核型較為規(guī)則，染色質(zhì)塊狀，核仁不明顯或缺乏，胞質(zhì)少，外形規(guī)則或輕度嗜堿。漿樣淋巴細胞胞質(zhì)偏于一側(cè)，似鞋形、船形，染色質(zhì)類似小淋巴細胞。漿細胞輕度增多形態(tài)以成熟漿細胞為主，幼稚及形態(tài)異常的漿細胞少見。

2.3 流式細胞免疫表型 14例LPL/WM患者均可見兩類腫瘤性細胞：克隆性小B細胞和克隆性漿細胞。小B細胞的免疫表型：CD20、CD19、CD22及sIgM的陽性率為100%，CD23陽性率為14.2%，CD10、CD5均陰性，限制性表達輕鏈Kappa陽性率為92.8%，限制性表達輕鏈Lambda陽性率為7.14%。漿細胞免疫表型：CD19陽性率為92.8%，CD138、CD38的陽性率為100%，CD56陰性，限制性表達輕鏈Kappa陽性率為92.8%(13/14)，限制性表達輕鏈Lambda陽性率為7.14%。

2.4 MYD88基因L265P突變檢測結(jié)果 14例患者MYD88野生型與突變型CT值差值均<8，即均為陽性(圖1)。

圖1 MYD88基因野生型和突變型檢測：2條擴增曲線分別與閾值線有一個交點(交點所對應的橫坐標即CT值)，2條擴增曲線CT值差值小于4

2.5 淋巴結(jié)活檢 11例淋巴結(jié)活檢，鏡檢顯示淋巴結(jié)結(jié)構(gòu)被腫瘤性細胞破壞，部分病例可見殘存的濾泡及淋巴竇，腫瘤主要由小淋巴細胞、漿細胞和漿樣淋巴細胞構(gòu)成(圖2)。小淋巴細胞比正常成熟淋巴細胞稍大，細胞質(zhì)較少，核圓形或輕度不規(guī)則，染色質(zhì)粗，核仁不明顯；腫瘤性漿細胞體積比正常漿細胞大，細胞核增大，染色質(zhì)凝集，車輻狀結(jié)構(gòu)不明顯。漿樣淋巴細胞的細胞核與小淋巴細胞相似，呈偏心分布，細胞質(zhì)相對豐富。其中1例患者(例4)的淋巴結(jié)被兩類腫瘤性細胞完全破壞：(1)大細胞：該細胞以浸潤淋巴竇為特征，淋巴竇擴張明顯，呈巢狀、裂隙狀或不規(guī)則的分枝吻合狀，部分區(qū)域融合成片；細胞形態(tài)呈圓形、多邊形，細胞質(zhì)豐富，嗜酸，胞質(zhì)境界清楚或略顯不清，細胞核大，圓形、腎形、多形性，有些細胞核呈胚胎樣、花環(huán)樣及RS樣，核膜清晰，染色質(zhì)粉塵狀或凝集成細顆粒狀，有1至數(shù)個嗜酸性大核仁；核分裂象易見。(2)小細胞：位于淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)和邊緣竇，此類細胞包括小淋巴細胞、漿樣淋巴細胞及漿細胞，漿細胞呈小簇狀或混雜于小淋巴細胞中。在部分區(qū)域中大小細胞混雜，界限模糊。11例WM患者淋巴結(jié)活檢組織免疫表型：WM患者均表達CD20(圖3)，10例限制性表達輕鏈Kappa(圖4)，1例限制性表達輕鏈Lambda，1例表達CD23(圖5)，11例患者均不表達CD5及CD10，腫瘤性的小細胞Ki-67增殖指數(shù)5%～30%。其中1例(例4)患者小淋巴細胞區(qū)域：CD20、CD38及MUM1呈條索狀或灶狀陽性，限制性表達輕鏈Lambda，CD21顯示縮小不完整的FDC網(wǎng)，BCL-6及CD10顯示殘存生發(fā)中心，CD30陰性；大淋巴細胞區(qū)域：CD30(圖6)、CD20、MUM1、BCL-2均彌漫陽性，Ki-67增殖指數(shù)>80%，Lambda、Kappa、CD21、CD23、BCL-6及CD10均陰性(表3)。

表3 11例LPL/WM淋巴結(jié)活檢的免疫表型

*LPL/WM伴CD30陽性彌漫大B細胞淋巴瘤；LPL/WM.淋巴漿細胞淋巴瘤/華氏巨球蛋白血癥

2.6 隨訪 14例LPL/WM患者均獲得隨訪，其中1例因癥狀較輕未接受治療，隨訪6個月，病情未見明顯進展；7例患者經(jīng)6個月FCD(氟達拉濱、環(huán)磷酰胺、地塞米松)治療后，癥狀明顯改善，隨訪12個月，均存活。5例經(jīng)氟達拉濱聯(lián)合利妥昔單抗治療6個月后基本治愈，隨訪6年，均存活；伴高級別轉(zhuǎn)化的1例經(jīng)R-CVP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松)3個療程后，癥狀有所改善，第5個療程中病情惡化，患者因多器官衰竭，死亡。

②③④⑤⑥圖2 形態(tài)相對單一的淋巴細胞、漿樣淋巴細胞及漿細胞 圖3 CD20呈彌漫陽性,EliVision兩步法 圖4 Kappa呈胞質(zhì)彌漫陽性,EliVision兩步法 圖5 例2:CD23呈彌漫陽性,EliVision兩步法 圖6 例4:大細胞區(qū)域中CD30呈彌漫陽性,小細胞區(qū)域中CD30呈陰性,EliVision兩步法

3 討論

LPL/WM在西方國家報道較多[2-3]，好發(fā)于老人，中位年齡為63～68歲，男性多于女性。本組男性多見，中位年齡59歲，略低于歐美國家(67～78歲)，發(fā)病年齡與國內(nèi)文獻相近[4]。本組患者中位M蛋白水平為48.0 g/L，接近西方文獻報道。血清克隆性IgM升高及不同程度的貧血是最早出現(xiàn)的血液系統(tǒng)異常。IgM在循環(huán)血中的增多，可導致高粘滯血癥，通常血中IgM水平≥30 g/L時才會出現(xiàn)臨床癥狀[5]，本組病例中有高粘滯性表現(xiàn)的患者IgM水平均高于30 g/L，與文獻報道相符。<10%的患者可出現(xiàn)慢性自身免疫性溶血性貧血[6]，本組有2例Coomb試驗陽性提示伴有自身免疫性溶血現(xiàn)象?？寺⌒訧gM并不是LPL/WM的診斷性特征，因為其還可以出現(xiàn)在其他淋巴細胞腫瘤或無明顯腫瘤跡象的患者[7]。

盡管LPL/WM以浸潤骨髓為主，但也可浸潤其他器官，常見于淋巴結(jié)及肝脾。本組患者中肝或脾及淋巴結(jié)腫大者均高于國內(nèi)、外報道，與本組入選患者均為有癥狀的WM相關。丙型肝炎感染與WM發(fā)病有相關性，丙型病毒感染并不影響WM的總生存期，但可影響患者的臨床表現(xiàn)，其整體生存質(zhì)量較差[8]，本組中有2例伴丙型肝炎感染，其貧血程度較為嚴重。在14例WM患者的骨髓中除小淋巴細胞、漿樣淋巴細胞及漿細胞侵犯外，還可見肥大細胞增多，其可促進瘤細胞的增生[9]。2019年美國國立綜合癌癥網(wǎng)(NCCN)診治指南強調(diào)WM/LPL的診斷需結(jié)合骨髓細胞形態(tài)學與流式免疫表型檢測[10]；其腫瘤性小淋巴細胞典型的免疫表型為sIgM、CD19、CD20、CD22均陽性，有10%～20%的患者表達CD5、CD10或CD23。本組有2例表達CD23，CD5及CD10均未見表達，可能與病例數(shù)較少相關。腫瘤性漿細胞的免疫組化表達CD138、CD38，不表達胞膜免疫球蛋白，胞質(zhì)免疫球蛋白呈輕鏈限制性表達且與小B細胞輕鏈的限制性表達一致。這與漿細胞腫瘤的漿細胞不同，LPL/WM的漿細胞表達CD45、CD19，不表達CD56，可資鑒別[11]。

LPL/WM侵犯淋巴結(jié)通常缺乏特征性形態(tài)學改變，與其他伴有明顯漿細胞樣分化的小B細胞淋巴瘤非常相似；LPL/WM淋巴結(jié)組織免疫表型與骨髓流式細胞免疫表型基本一致，如果表達CD5、CD10或CD23時，不能僅憑該免疫表型排除WM，需結(jié)合其他實驗室檢查輔助診斷。另有少部分的LPL/WM病例可向高級別大B細胞淋巴瘤轉(zhuǎn)化[12]，本組有1例LPL/WM與CD30陽性DLBCL并存于同一淋巴結(jié)內(nèi)，兩者均為克隆性進化，屬于第二腫瘤，一直以來均存在爭議，通過對LPL/WM與DLBCL免疫球蛋白重鏈基因互補決定區(qū)(CDR3)進行克隆相關性分析，可判定兩者是否具有克隆相關性[13]。本組對該例患者的骨髓及淋巴結(jié)分別進行IgH重鏈基因互補決定區(qū)(CDR3)克隆相關性分析，發(fā)現(xiàn)其有相同的克隆性；因此推斷CD30陽性DLBCL是由WM向高級別淋巴瘤轉(zhuǎn)化而來。DLBCL非特殊類型，形態(tài)具有多樣性，該例腫瘤性大細胞形態(tài)學屬于普通形態(tài)的間變型，其免疫表型除表達B細胞標記外，還表達CD30，亦符合間變型DLBCL的免疫表型特點[14]。國內(nèi)亦有報道CD30陽性大B細胞患者[15-16]，且與預后不良相關。

隨著分子生物學研究的不斷進展，為LPL/WM的確診和鑒別提供新的依據(jù)，有研究報道MYD88 L265P突變在WM中的發(fā)生率高達90%以上[17]，MYD88 L265P突變也可見于其他小B細胞淋巴瘤、DLBCL中。因此，MYD88 L265P突變是WM診斷及鑒別診斷的重要標志物，但非特異性診斷指標。

總之，LPL/WM屬于排他性診斷，目前尚無任何單一指標(形態(tài)學、免疫表型及基因檢測)成為LPL/WM診斷的金標準，必須綜合診斷。雖然LPL/WM可以通過骨髓及其他實驗室檢查診斷，但本組結(jié)果提示如有淋巴結(jié)腫大應盡可能獲取淋巴結(jié)組織標本進行病理學檢查，以除外合并或轉(zhuǎn)化為其他淋巴瘤的可能。