EAF2表達與前列腺癌上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系及臨床意義

涂 健，洪 蔭，汪 娟，崔紅霞，眭怡群，馮一中，張永勝，

前列腺癌是男性最常見的惡性腫瘤之一。近年由于新的輔助治療手段的推廣和腫瘤分子分型的廣泛應(yīng)用，前列腺癌的發(fā)病率和病死率均有所下降，但這些新療法所帶來的毒副作用也越來越受到重視，前列腺癌仍然是男性死亡的重要原因之一[1]。上皮細胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是去勢抵抗性前列腺癌重要的耐藥機制之一，EMT是多步驟的變化過程，最終可致前列腺癌上皮表型消失而獲得間質(zhì)表型，EMT可賦予腫瘤細胞轉(zhuǎn)移、侵襲以及干細胞特征[2-3]。EAF2是新發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，最初作為前列腺中雄激素反應(yīng)基因被發(fā)現(xiàn)[4]。EAF2在人前列腺癌組織和細胞系中的表達下調(diào)，EAF2的過表達可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染的前列腺癌細胞凋亡并抑制腫瘤的生長[5]。但其與EMT的關(guān)系尚未見報道，本文現(xiàn)分析EAF2和EMT標(biāo)志蛋白在前列腺癌組織中的表達，探討EAF2和EMT之間的關(guān)系及其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 收集蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科存檔的82例前列腺癌組織和46例良性前列腺組織。82例前列腺癌患者年齡55～94歲，平均72.9歲，>70歲者51例，≤70歲者31例。前列腺癌組織按照2010年AJCC分期標(biāo)準(zhǔn)分期：Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期47例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者20例；有隨訪資料者44例，隨訪時間61～96個月，平均72.8個月。所有患者均行手術(shù)切除治療，患者術(shù)前未接受放、化療或抗雄激素等治療。按照2016版與前列腺癌預(yù)后相關(guān)的WHO/ISUP分級分組系統(tǒng)將前列腺癌分為1～5個組別[6]。

前列腺組織芯片的制作：本實驗所有標(biāo)本均來自蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科，蠟塊均保存完好，可直接進行組織芯片的制作(圖1)，111個樣品點，合計82例前列腺癌組織及29例良性前列腺組織。

1.2 試劑 EAF2兔抗人抗體購自Abcam公司，E-cadherin兔抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物公司；vimentin和N-cadherin兔抗人多克隆抗體均購自北京博奧森生物公司；免疫組化檢測試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 免疫組化 前列腺癌組織蠟塊標(biāo)本4 μm厚切片，采用免疫組化SP法染色，操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說明書進行。一抗包括EAF2(1 ∶200)、E-cadherin(1 ∶300)、vimentin(1 ∶300)、N-cadherin(1 ∶300)，4 ℃孵育過夜。用PBS代替一抗作為陰性對照，已知染色陽性的前列腺癌組織切片作為陽性對照。

AB

圖1 前列腺癌組織芯片：A.組織蠟塊；B.HE切片

結(jié)果判定：EAF2表達定位于細胞核，按染色強度和陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比計分。(1)按染色強度計分：細胞未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色3分；(2)按陽性細胞百分比計分：陽性細胞數(shù)占0～1%為0分，2%～24%為1分，25%～49%為2分，50～74%為3分，75～100%為4分；將兩項得分結(jié)果相乘：≥3分為陽性[7]。E-cadherin主要表達于細胞膜，>50%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性；N-cadherin表達定位于細胞膜和(或)細胞質(zhì)，>10%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性；vimentin主要表達于細胞質(zhì)，>10%的細胞呈棕黃色顆粒為陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 18.0軟件對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用χ2檢驗和Pearson相關(guān)檢驗進行EAF2表達與EMT標(biāo)志蛋白的相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier法進行生存分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EAF2在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達 EAF2染色陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒，主要定位于細胞核(圖2)。EAF2蛋白在良性前列腺組織中的陽性率為69.57%，顯著高于前列腺癌組織(40.24%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1)。

表1 EAF2在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達[n(%)]

ABCD

圖2 EAF2在前列腺癌組織中的表達：A.陰性；B.弱陽性；C.中等陽性；D.強陽性，SP法

2.2 EMT標(biāo)志物在前列腺癌組織和良性前列腺組織中的表達 免疫組化結(jié)果顯示，EMT相關(guān)標(biāo)志物E-cadherin和N-cadherin表達定位于細胞膜，vimentin表達定位于細胞質(zhì)(圖3)。前列腺癌組織中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的陽性率分別為39.01%、21.95%和75.61%。良性前列腺組織中E-cadherin、vimentin和N-cadherin的陽性率分別為78.23%、15.74%和5.62%。

2.3 EAF2表達與前列腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系 EAF2蛋白表達與前列腺癌臨床分期(P=0.007，表2)、WHO/ISUP病理分組相關(guān)(P=0.016，表2)，與患者年齡、淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、脈管有無轉(zhuǎn)移及神經(jīng)有無侵犯等均無關(guān)(P>0.05，表2)。生存分析結(jié)果顯示，前列腺癌組織中EAF2陽性患者的總生存期高于EAF2陰性患者(P=0.044，圖4)。

2.4 EAF2表達與前列腺癌EMT標(biāo)志蛋白表達之間的關(guān)系 Pearson相關(guān)檢驗分析前列腺癌組織中EAF2的表達與E-cadherin、vimentin、N-cadherin的相關(guān)性，結(jié)果顯示，EAF2與E-cadherin表達呈正相關(guān)(r=0.363，P=0.001)，與vimentin(r=-0.255，P=0.021)和N-cadherin表達(r=-0.271，P=0.014)呈負相關(guān)(表3)。

ABC

圖3 EMT標(biāo)志物在前列腺癌組織中的表達：A.vimentin；B.N-cadherin；C.E-cadherin，SP法

表2 EAF2表達與前列腺癌臨床病理特征的相關(guān)性

圖4 Kaplan-Meier法分析EAF2表達與前列腺癌患者生存時間的關(guān)系

表3 EAF2表達與前列腺癌EMT標(biāo)志蛋白表達的相關(guān)性

3 討論

目前，前列腺癌的治療以手術(shù)切除、去勢治療以及放化療為主要治療手段，整體預(yù)后良好，但多數(shù)患者最終會轉(zhuǎn)變?yōu)槿莸挚剐郧傲邢侔?，大量研究表明去勢抵抗性前列腺癌中腫瘤細胞出現(xiàn)了干細胞特征并表達分化特征的相關(guān)因子從而發(fā)生EMT[8-9]，EMT常表現(xiàn)為表面標(biāo)記蛋白表達的變化：E-cadherin、cytokeratin等上皮標(biāo)志物減少，vimentim、N-cadherin、fibronectin等間質(zhì)標(biāo)志物增加。因此，可以通過檢測這些標(biāo)志物來鑒定EMT的發(fā)生[10]。EMT可以導(dǎo)致前列腺癌的治療抵抗以及轉(zhuǎn)移[11]，研究表明TGF-β在EMT中扮演重要角色，通過與雄激素受體(AR)軸相互作用，促進前列腺癌轉(zhuǎn)移、侵襲以及耐藥性[12]。

研究表明EAF2可以通過直接結(jié)合pVHL位點來調(diào)節(jié)低氧誘導(dǎo)因子(HIF1-α)以及腫瘤血管生成[13]。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)在低氧條件下，HIF1-α可以誘導(dǎo)EAF2的表達上調(diào)，而EAF2可以抑制HIF1-α的轉(zhuǎn)錄活性。EAF2可以和抑癌基因p53作用來調(diào)節(jié)血栓反應(yīng)蛋白1(TSP-1)進一步抑制內(nèi)皮細胞的增殖和遷移[15]，本組實驗結(jié)果表明，EAF2在良性前列腺組織中的表達高于前列腺癌組織，提示抑癌基因EAF2可能抑制前列腺癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移。本組實驗結(jié)果提示，EAF2在臨床分期Ⅲ+Ⅳ期患者中的表達水平低于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期患者，提示EAF2陰性者預(yù)后更差。而WHO/ISUP分級分組結(jié)果提示，前列腺癌高分組中EAF2蛋白表達水平低于前列腺癌低分組，WHO/ISUP分級分組和前列腺癌病理學(xué)Gleason評分和預(yù)后密切相關(guān)，因此本組實驗結(jié)果提示，EAF2蛋白表達和前列腺癌組織學(xué)分級以及預(yù)后具有一定相關(guān)性，生存分析結(jié)果表明，EAF2陽性前列腺癌患者的整體生存率高于EAF2陰性患者，表明其表達與患者預(yù)后有一定的相關(guān)性，其臨床意義有待深入探討。

研究表明EAF2和p53共同調(diào)節(jié)并抑制STAT3的表達和磷酸化過程，抑制了前列腺癌的生長[16]，而目前已知STAT3在前列腺癌及其他多種腫瘤中促進EMT的過程[17-19]，但EAF2與EMT的關(guān)系未見報道，作者在前列腺癌組織水平分析了EAF2的表達與EMT標(biāo)志蛋白表達的關(guān)系，本組實驗結(jié)果表明，EAF2與E-cadherin表達呈正相關(guān)，與N-cadherin和vimentin表達呈負相關(guān)；進一步的檢測發(fā)現(xiàn)EAF2高表達的前列腺癌組織中，E-cadherin亦高表達，而vimentin和N-cadherin低表達，反之亦然，以上結(jié)果提示EAF2與前列腺癌的EMT表型有關(guān)，EAF2可能通過上調(diào)E-cadherin以及下調(diào)vimentin和N-cadherin的表達來抑制EMT的發(fā)生，從而抑制前列腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移，而EAF2與EMT具體的關(guān)聯(lián)和機制如何則有待積累大樣本進行深入分析。探討EAF2和EMT在前列腺癌中的表達水平及其相關(guān)性對揭示前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展機制有指導(dǎo)意義，并為進一步的前列腺癌診斷和治療提供理論依據(jù)。