胃癌中FOXD3的表達(dá)及其與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

鄒長(zhǎng)棪，林華妹，胡 丹，蘇 穎，夏 言，鄭雄偉,3，林賢東,3

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，病死率位居惡性腫瘤的第3位[1]。雖然近年胃鏡檢查等早期篩查手段逐漸得到重視，新輔助化療、手術(shù)、靶向藥物治療等腫瘤綜合治療手段顯著提高，但全球胃癌的發(fā)病率和病死率仍呈上升趨勢(shì)[1-2]。因此，探索胃癌在分子水平的發(fā)生、發(fā)展，積極尋找有效的早期檢測(cè)手段和治療方法是胃癌防治的迫切任務(wù)。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子D3(forkhead box D3, FOXD3)是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一，參與胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)嵴細(xì)胞系的形成、遷移和分化[3]。在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)控作用，慢性淋巴細(xì)胞白血病、黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、肝癌和肺癌等均可見FOXD3異常表達(dá)[4-7]。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化EnVision法和qRT-PCR法檢測(cè)FOXD3在胃癌及癌旁組織的表達(dá)，初步探討其表達(dá)水平與胃癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，通過分析FOXD3與β-catenin表達(dá)的關(guān)系，探討FOXD3與腫瘤信號(hào)通路的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本 收集2014～2015年福建省腫瘤醫(yī)院存檔的78例胃癌手術(shù)切除標(biāo)本，并取相應(yīng)的癌旁組織作為對(duì)照組，患者術(shù)前均未接受過任何治療，術(shù)后經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為胃癌。78例胃癌中，男性61例，女性17例，中位年齡61歲(39～82歲)。新鮮組織獲取后立即放入液氮保存，隨后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，整個(gè)收集過程及保存過程均按照無酶原則操作。隨訪時(shí)間從明確診斷開始至末次隨訪或死亡，以月為單位。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)福建省腫瘤醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入患者均在術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器 Trizol、qRT-PCR提取試劑盒購自德國QIAGEN公司，qRT-PCR擴(kuò)增試劑盒購自德國羅氏公司LightCycler 480 SYBR Green I Master，β-catenin購自北京中杉金橋公司，DAB顯色試劑盒購自羅氏公司。PCR擴(kuò)增儀為Eppendof Mastercycler Gradient公司。qRT-PCR儀器為Roche LightCycler 480Ⅱ。全自動(dòng)免疫組化染色儀為羅氏公司Benchmark XT。

1.3 qRT-PCR 取100 mg凍存新鮮組織液氮環(huán)境下研磨成粉末狀，加入1 mL Trizol，靜置10 min后抽提mRNA。使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明書將提取RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR按照SyberGreen說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 10 min、95 ℃ 2 s、60 ℃ 20 s、70 ℃ 10 s，40個(gè)循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線檢測(cè)。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。以GAPDH為內(nèi)參基因?qū)Ω骰虮磉_(dá)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，同時(shí)以T-177892癌組織表達(dá)為準(zhǔn)(calibrator)對(duì)其他標(biāo)本進(jìn)行量化，即它的表達(dá)量設(shè)為1，量化其他樣本的表達(dá)量；采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量的RQ值，為了便于統(tǒng)計(jì)，把RQ值取lg進(jìn)行分析[8]。

1.4 免疫組化 免疫組化染色采用EnVision法，將石蠟包埋組織4 μm厚切片，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。β-catenin(UMAB15，北京中杉金橋公司)為即用型抗體，用羅氏全自動(dòng)免疫組化染色儀染色，孵育40 min，完成自動(dòng)染色過程。陽性對(duì)照采用已知陽性病例，陰性對(duì)照用PBS代替一抗。β-catenin表達(dá)定位于胞核。染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：鏡下以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒為陽性。采用半定量積分法判斷結(jié)果。(1)按陽性細(xì)胞百分率計(jì)分：陽性細(xì)胞數(shù)占1%～10%為1分，11%～50%為2分，≥51%為3分；(2)按細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：未著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。將兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～4分為陰性，5～9分為陽性[9]。結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，配對(duì)資料的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)；兩組間的比較先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)及方差齊性分析，后進(jìn)行兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法進(jìn)行免疫組化結(jié)果分析；采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 qRT-PCR法檢測(cè)FOXD3 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá) qRT-PCR法檢測(cè)78例胃癌及癌旁組織中FOXD3 mRNA的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌組織中FOXD3 mRNA的表達(dá)量為0.146±0.036(lgRQ，RQ=2-ΔΔCt)，相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)量為-0.379±0.107，上調(diào)3.35倍，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。表明FOXD3 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁組織。

2.2 FOXD3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 將78胃癌按照WHO組織分型，中+高分化胃癌組32例，F(xiàn)OXD3的表達(dá)量為0.24±0.04；低分化胃癌組46例，表達(dá)量為0.08±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.03)。按照Lauren分型，腸型胃癌組29例，F(xiàn)OXD3的表達(dá)量0.23±0.05；彌漫型胃癌組49例，表達(dá)量為0.09±0.05，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.04)，表明FOXD3表達(dá)與胃癌分化程度和Lauren分型密切相關(guān)。而FOXD3表達(dá)與患者性別、年齡，腫瘤部位、大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯及EBER感染無顯著相關(guān)性(P>0.05，表1)。

圖1 qRT-PCR法檢測(cè)FOXD3 mRNA在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)：紅線表示每組的平均值

表1 FOXD3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

*P<0.05

2.3 FOXD3表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 78例胃癌組織中FOXD3的相對(duì)表達(dá)量lgRQ符合正態(tài)分布，故取中位數(shù)0.18將其分為高表達(dá)量組(41例)和低表達(dá)量組(37例)。

78例胃癌患者從明確診斷開始隨訪，隨訪時(shí)間1～49個(gè)月，其中27例死亡，9例失訪。FOXD3高表達(dá)組36例，死亡19例(52.8%)，平均生存時(shí)間(31.7±3.1)個(gè)月；FOXD3低表達(dá)組33例，死亡8例(24.2%)，平均生存時(shí)間(38.4±2.7)個(gè)月。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，結(jié)果顯示FOXD3高表達(dá)組總體生存率(overall survival, OS)比低表達(dá)組差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046，圖2)。

圖2 FOXD3表達(dá)胃癌患者的生存曲線

2.4 胃癌組織中FOXD3表達(dá)與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性 β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，可將信號(hào)從胞質(zhì)傳到細(xì)胞核，啟動(dòng)核內(nèi)特定基因的表達(dá)。正常情況下，β-catenin蛋白主要存在于正常細(xì)胞胞膜，基因突變后導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)堆積。因此，β-catenin在核內(nèi)表達(dá)才確認(rèn)為陽性(圖3A、B)。

AB

圖3 β-catenin在胃癌組織中的表達(dá)：A.β-catenin低表達(dá)；B.β-catenin高表達(dá)，EnVision法

據(jù)上述以FOXD3表達(dá)量的中位數(shù)(0.18)將78例胃癌患者分為高表達(dá)量組(41/78)和低表達(dá)量組(37/78)。在檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)的基礎(chǔ)上，通過Spearsman等級(jí)相關(guān)法分析，結(jié)果顯示：FOXD3表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.280，P=0.023，表2)。

表2 胃癌組織中FOXD3表達(dá)與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

FOX蛋白家族是一類廣泛存在于動(dòng)植物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子，其在細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)和細(xì)胞周期的調(diào)控、胚胎發(fā)育、免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要作用[10]。FOXD3是FOX轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員之一。FOXD3有維持脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育和胚胎干細(xì)胞多能性，調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞系的形成、遷移和分化的功能，且在決定正?；驉盒耘咛ジ杉?xì)胞繼續(xù)增殖還是分化的過程中起關(guān)鍵作用[3,11]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)OXD3與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用[12]。

本實(shí)驗(yàn)通過qRT-PCR法檢測(cè)胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中FOXD3的表達(dá)，結(jié)果顯示胃癌組織中FOXD3的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，處于高表達(dá)狀態(tài)。王旭等[13]利用qRT-PCR和免疫組化法分析子宮頸癌組織及癌旁組織中FOXD3的表達(dá)[13]，結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3 mRNA及蛋白的表達(dá)水平均高于正常子宮頸組織。臧星卉等[14]在上皮性卵巢癌組織中的研究結(jié)果顯示FOXD3表達(dá)水平高于卵巢良性上皮性腫瘤組織和正常的卵巢，進(jìn)一步研究表明，F(xiàn)OXD3可能參與上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展。以上結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3在癌組織中呈高表達(dá)，與本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Chu等[6]在乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，相對(duì)癌旁組織，乳腺癌組織中FOXD3呈低表達(dá)，F(xiàn)OXD3低表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXD3高表達(dá)抑制腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。以上結(jié)果表明，F(xiàn)OXD3在不同類型的組織樣本中存在異質(zhì)性，其功能也不盡相同。

本組實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析了FOXD3的表達(dá)量與胃癌不同臨床病理特征的關(guān)系及患者術(shù)后OS的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)FOXD3表達(dá)與胃癌分化和Lauren分型密切相關(guān)，且胃癌組織中FOXD3高表達(dá)組OS較低表達(dá)組差(P<0.05)。在乳腺癌、直腸癌、肺癌、甲狀腺癌及惡性黑色素瘤等腫瘤中均發(fā)現(xiàn)FOXD3異常表達(dá)與腫瘤臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)。Bao等通過qRT-PCR分析131例肺癌血清中FOXD3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FOXD3異常表達(dá)與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分化密切相關(guān)。ROC曲線表明，F(xiàn)OXD3可作為非小細(xì)胞肺癌患者的診斷生物學(xué)標(biāo)志物[7]。印永祥等[15]在乳腺癌中研究顯示，F(xiàn)OXD3表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與其他類型乳腺癌相比，三陰型乳腺癌中FOXD3表達(dá)明顯增加。Li等[16]在分析胃癌TCGA數(shù)據(jù)結(jié)果表明，F(xiàn)OXD3的低表達(dá)和高表達(dá)的5年OS和無瘤生存率(disease free survival, DFS)分別為43.1%、55.9%和37.2%以及46.7%，高水平的FOXD3表達(dá)與不良的OS和DFS預(yù)后相關(guān)。以上結(jié)果均表明，F(xiàn)OXD3在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，可能是獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

為了進(jìn)一步探討FOXD3在胃癌中的作用，通過免疫表型分析FOXD3表達(dá)與Wnt/β-catenin信號(hào)相關(guān)蛋白的相關(guān)性，結(jié)果顯示：FOXD3表達(dá)與β-catenin表達(dá)呈顯著正相關(guān)。正常情況下，β-catenin蛋白主要存在于正常細(xì)胞的胞膜，基因突變后導(dǎo)致細(xì)胞核內(nèi)堆積。β-catenin是Wnt信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，可將信號(hào)從胞質(zhì)傳到細(xì)胞核，啟動(dòng)核內(nèi)特定基因的表達(dá)。以上結(jié)果提示，F(xiàn)OXD3異常表達(dá)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一類在生物體進(jìn)化過程中重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化、極化、凋亡與抗凋亡等過程，該信號(hào)通路的異常與包括癌癥在內(nèi)的多種疾病相關(guān)[17-18]。胃癌的發(fā)生、發(fā)展也與Wnt/β-catenin信號(hào)的活化存在密切的聯(lián)系。其參與胃癌細(xì)胞的周期調(diào)控，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移等[19]。據(jù)報(bào)道FOXD3可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號(hào)通路促進(jìn)小鼠外胚層干細(xì)胞的自我更新[20]。FOXD3/microRNA-496可調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用[21]。這些研究提示FOXD3可能與調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin通路的功能有關(guān)，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3與β-catenin的表達(dá)呈正相關(guān)，但FOXD3是否通過Wnt/β-catenin促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，仍需進(jìn)一步深入探討。

綜上所述，本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)OXD3在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，并且與腫瘤組織分化、Lauren分型及預(yù)后密切相關(guān)。FOXD3可能是判斷胃癌預(yù)后的分子標(biāo)志物。FOXD3可能通過Wnt/β-catenin信號(hào)促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展，還有待于深入探討。