EGFR基因擴(kuò)增在食管鱗狀細(xì)胞癌中的預(yù)后價(jià)值

朱 娜，蔣冬先，侯英勇

食管癌是中國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其中鱗狀細(xì)胞癌是食管癌最常見(jiàn)的組織類型?；颊咴谠\斷時(shí)常已處于晚期，因此預(yù)后極差。盡管手術(shù)治療、放療、化療不斷在進(jìn)展，但5年生存率仍不足20%。近些年，分子靶向治療已經(jīng)成為一種重要的治療方法。表面生長(zhǎng)因子受體(epidemal growth factor receptor, EGFR)家族包含4個(gè)成員，EGFR、ErbB2/HER-2、ErbB3/HER-3和ErbB4/HER-4，作為酪氨酸激酶受體，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、控制細(xì)胞增殖和分化中起重要作用。EGFR或HER-2基因擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)在食管癌中經(jīng)常發(fā)生，食管鱗狀細(xì)胞癌主要表現(xiàn)為EGFR基因擴(kuò)增，而食管腺癌主要表現(xiàn)為HER-2基因擴(kuò)增。根據(jù)EGFR基因在腫瘤細(xì)胞生物學(xué)中的作用和在食管鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，EGFR基因很可能是食管鱗狀細(xì)胞癌很重要的治療靶點(diǎn)之一。但根據(jù)目前的研究，EGFR基因改變情況需要更大宗的數(shù)據(jù)分析，其與食管鱗狀細(xì)胞癌臨床病理特征之間的相關(guān)性及預(yù)后的關(guān)系仍不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在探討EGFR基因擴(kuò)增在食管鱗狀細(xì)胞癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2007～2010年復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院胸外科診治的504例食管鱗狀細(xì)胞癌患者。所有患者在手術(shù)前均未接受放、化療。所有患者均簽署書面知情同意書。

1.2 方法 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，制作組織芯片(tissue microarray,TMA)。4 μm厚切片，行HE染色和FISH檢測(cè)。臨床病理相關(guān)因素包括患者性別、年齡、吸煙史、腫瘤部位(食管上段、中段及下段)、腫瘤直徑(以3.3 cm為界限分兩組)、分化程度(高、中、低)、脈管侵犯情況、神經(jīng)侵犯情況、腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期(分Ⅰ+Ⅱ、Ⅲ+Ⅳa兩組)。雙色EGFR探針中紅色信號(hào)探針為EGFR探針，特異性定位在EGFR基因座(7p12)，綠色信號(hào)探針為7號(hào)染色體著絲粒探針(7p11.1-q11.1)。具體操作步驟類似于之前報(bào)道的HER-2-FISH過(guò)程[1]。

連續(xù)計(jì)數(shù)至少100個(gè)腫瘤細(xì)胞EGFR信號(hào)，可分為6種類型：(1)二倍體：>90%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≤2；(2)低三倍體：10%～40%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≤3；(3)高三倍體：≥40%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≤3；(4)低多倍體：10%～40%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≥4；(5)高多倍體：>40%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≥4；(6)基因擴(kuò)增：EGFR基因簇狀擴(kuò)增，或EGFR/CEP7≥2，或≥10%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)≥15。EGFR基因FISH陽(yáng)性被定義為EGFR高多倍體或基因擴(kuò)增[2-3]。

1.3 隨訪 504例患者均獲得完整隨訪資料。隨訪資料來(lái)自于病歷記錄、電話隨訪以及家訪。隨訪時(shí)間截至2015年11月。無(wú)瘤生存期(disease-free survival, DFS)和總生存期(overall survival, OS)指從手術(shù)切除時(shí)間到第一次腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間(或最近隨訪時(shí)間)和死亡時(shí)間。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 χ2檢驗(yàn)用于單因素分析，不同評(píng)分系統(tǒng)的一致性通過(guò)Kappa進(jìn)行測(cè)量，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異通過(guò)McNemar檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用Kaplan-Meier分析計(jì)算DFS和OS。Log-rank檢驗(yàn)用于比較生存分析中作為變量函數(shù)的DFS和OS，并用于識(shí)別差異的顯著性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床特征與分組 504例食管鱗狀細(xì)胞癌中，男女比約5 ∶1。以中下段食管鱗狀細(xì)胞癌為主。以中～低分化為主(96.2%)。腫瘤直徑以3.3 cm為界值，直徑<3.3 cm病例稍多于直徑≥3.3 cm的病例數(shù)。脈管、神經(jīng)侵犯的病例數(shù)明顯少于未侵犯的病例數(shù)。根據(jù)腫瘤的浸潤(rùn)深度，以T2、T3為主，即癌組織多侵及肌層及外膜層。54.0%的病例未見(jiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

按照AJCC第8版食管癌分期數(shù)值，將腫瘤分期分為Ⅰ+Ⅱ(55.6%)及Ⅲ+Ⅳa(44.4%)兩組。根據(jù)生存時(shí)間分段，將患者分為小于24個(gè)月及大于24個(gè)月兩組。

2.2 食管鱗狀細(xì)胞癌中EGFR基因擴(kuò)增與臨床病理特征的關(guān)系 EGFR-FISH陽(yáng)性共61例(12.1%)，EGFR-FISH擴(kuò)增共32例(6.3%)(圖1，表1)。

AB

圖1 A.EGFR高多倍體：腫瘤細(xì)胞內(nèi)紅綠色信號(hào)比增加(70%腫瘤細(xì)胞拷貝數(shù)約≥4)；B.EGFR基因擴(kuò)增：腫瘤細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)簇狀擴(kuò)增紅色信號(hào)(紅色信號(hào)代表EGFR基因，綠色信號(hào)代表CEP7)

2.3 食管鱗狀細(xì)胞癌中EGFR基因擴(kuò)增與預(yù)后的關(guān)系 504例食管鱗狀細(xì)胞癌患者EGFR-FISH不同檢測(cè)結(jié)果分別在全部患者、Ⅰ+Ⅱ期患者、Ⅲ+Ⅳa期患者、生存期小于24個(gè)月患者及生存期大于24個(gè)月患者等5種不同人群的DFS及OS中進(jìn)行預(yù)后分析。其中EGFR-FISH陽(yáng)性與擴(kuò)增結(jié)果對(duì)比，在全部患者、Ⅲ+Ⅳa期患者及生存期小于24個(gè)月的患者中未顯示明顯差異，而在Ⅰ+Ⅱ期患者及生存期大于24個(gè)月的患者中差異有顯著性(表2)。EGFR-FISH擴(kuò)增在全部患者、Ⅰ+Ⅱ期患者及生存期大于24個(gè)月的患者中DFS及OS差異有顯著性(圖2)。

表1 504例食管鱗狀細(xì)胞癌中EGFR-FISH結(jié)果與臨床病理特征的相關(guān)性

表2 504例食管鱗狀細(xì)胞癌患者EGFR-FISH檢測(cè)結(jié)果在不同人群中的預(yù)后意義

圖2 EGFR基因擴(kuò)增組與非擴(kuò)增組在總?cè)巳?A、B)、Ⅰ+Ⅱ期患者(C、D)及生存時(shí)間大于24個(gè)月的患者(E、F)中的總生存期和無(wú)瘤生存期的生存曲線；0代表EGFR-FISH非擴(kuò)增組；1代表EGFR-FISH擴(kuò)增組

3 討論

中國(guó)屬于食管癌高危區(qū)，鱗狀細(xì)胞癌是主要的組織學(xué)類型。男女間的發(fā)生率具有很大的地區(qū)差異，在中國(guó)主要以男性為主。吸煙是食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生的一個(gè)主要危險(xiǎn)因素。食管癌主要位于食管中1/3段，隨后依次為下1/3段和上1/3段，有數(shù)據(jù)顯示位于上段和中段的鱗狀細(xì)胞癌比下段的鱗狀細(xì)胞癌更具有侵襲性。TNM分期、腫瘤的分化程度及位于食管的位置都作為預(yù)后分組因素。此研究數(shù)據(jù)顯示的食管鱗狀細(xì)胞癌的臨床特征與其流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致，且樣本量大，因此通過(guò)本組實(shí)驗(yàn)分析能充分、準(zhǔn)確展示EGFR基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中的作用。

EGFR基因改變?cè)诎┲兄饕譃閮深悾阂活愂荅GFR基因第18～21號(hào)外顯子的位點(diǎn)突變，主要發(fā)生在亞洲肺腺癌[4]；另一類是EGFR基因擴(kuò)增和蛋白的過(guò)表達(dá)[5]。EGFR基因在食管鱗狀細(xì)胞癌中主要是基因拷貝數(shù)的改變[6-8]，罕見(jiàn)基因位點(diǎn)突變[1,9]。關(guān)于EGFR基因擴(kuò)增與過(guò)表達(dá)之間的關(guān)系在近期很多文獻(xiàn)中進(jìn)行了討論，兩者存在相關(guān)性(P<0.01)，其中存在基因擴(kuò)增者均有EGFR蛋白過(guò)表達(dá)[5]。文獻(xiàn)報(bào)道顯示，具有EGFR擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)的食管鱗狀細(xì)胞癌受益于西妥昔單抗治療[10]。本組實(shí)驗(yàn)主要應(yīng)用FISH技術(shù)探索EGFR基因拷貝數(shù)的改變?cè)谑彻荀[狀細(xì)胞癌中的價(jià)值。首先，本組實(shí)驗(yàn)用FISH檢測(cè)EGFR基因變化情況與之前文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的數(shù)據(jù)一致，包括二倍體、低三倍體、高三倍體、低多倍體、高多倍體及基因擴(kuò)增[7]。其中EGFR-FISH高多倍體及基因擴(kuò)增具有較高的比例(12.1%)。文獻(xiàn)報(bào)道中食管鱗狀細(xì)胞癌的樣本量相對(duì)不足(多不足100例)，而本組實(shí)驗(yàn)共獲取504例食管鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本，相比更能反映EGFR基因改變?cè)谑彻荀[狀細(xì)胞癌中的真實(shí)情況。其次，文獻(xiàn)中指出EGFR基因擴(kuò)增狀態(tài)與患者腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈正相關(guān)，提示EGFR基因拷貝數(shù)的增加與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移等行為密切相關(guān)[11]。本組實(shí)驗(yàn)利用FISH技術(shù)探索EGFR基因拷貝數(shù)改變，其中EGFR-FISH陽(yáng)性包括高多倍體和基因擴(kuò)增，在探索EGFR基因改變?cè)谑彻荀[狀細(xì)胞癌中的價(jià)值時(shí)，著重分析EGFR-FISH陽(yáng)性與EGFR-FISH擴(kuò)增兩組。

在EGFR-FISH與臨床病理因素的相關(guān)性分析中，EGFR-FISH陽(yáng)性與腫瘤的浸潤(rùn)深度具有一定的相關(guān)性，根據(jù)TNM分期，EGFR-FISH陽(yáng)性更常發(fā)生于T2、T3中，不出現(xiàn)在T4中，但顯著無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其他臨床病理特征，包括年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、脈管神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及臨床分期均無(wú)明顯相關(guān)性。

與EGFR-FISH陽(yáng)性組不同，EGFR基因擴(kuò)增與腫瘤浸潤(rùn)深度并無(wú)相關(guān)性，但在年齡、性別、吸煙史、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度、脈管神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征中，兩組相似，均與上述臨床病理特征無(wú)相關(guān)性。然而，EGFR基因擴(kuò)增與臨床分期密切相關(guān)，EGFR基因擴(kuò)增更容易發(fā)生于III+IVa期的食管鱗狀細(xì)胞癌患者。無(wú)論DFS或OS，EGFR基因擴(kuò)增在全部患者及Ⅰ+Ⅱ期患者中均具有更差的預(yù)后，尤其是在生存期超過(guò)24個(gè)月的患者中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

因此，在食管鱗狀細(xì)胞癌中具有一定比例的EGFR-FISH擴(kuò)增。EGFR-FISH擴(kuò)增與臨床病理特征密切相關(guān)，是食管癌中有價(jià)值的預(yù)后因子，而且相對(duì)EGFR-FISH陽(yáng)性而言，EGFR-FISH擴(kuò)增似乎更適合作為臨床實(shí)踐中的參考值。EGFR基因擴(kuò)增聯(lián)合其他基因的改變?cè)谑彻馨┲械膬r(jià)值也值得進(jìn)一步探討。