意大利蜜蜂哺育蜂學習記憶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄組學分析

高 艷, 朱雅楠, 張 威, 王雪妍, 李秋方, 蘇松坤, 聶紅毅

(福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院), 福州 350002)

蜂群一般由一頭蜂王、上百頭雄蜂和上萬頭工蜂組成 (Page and Peng, 2001)，隨著日齡的增加，工蜂的勞動分工也逐漸從巢內(nèi)轉(zhuǎn)向巢外(Robinson, 1992)。青年工蜂主要在巢內(nèi)活動，負責幼蟲和蜂王的飼喂與照料、巢房的清理等；老年工蜂主要在巢外活動，負責采粉、采蜜、采水、采膠等(Johnson, 2010)。哺育蜂在巢房內(nèi)不僅分泌蜂王漿飼喂蜂王和3日齡以內(nèi)的幼蟲，而且還能夠傳播蜂王信息物質(zhì)(Velthuis, 1972; Seely, 1979)。

哺育蜂哺育行為與蜂王漿分泌密切相關(guān)，目前基于哺育行為展開大量的分子生物學方面研究以期從分子角度闡明蜂王漿分泌機制(Fengetal., 2009; Uenoetal., 2009; Lietal., 2010; Liuetal., 2013)；此外工蜂在蜂群中的勞動分工也離不開哺育蜂哺育行為，從分子角度闡述蜂群勞動分工中相關(guān)基因的研究報道也不在少數(shù)(Shapiraetal., 2001; Kucharski and Maleszka, 2002; Tsuchimotoetal., 2004; Garciaetal., 2009; Johnson, 2010; Zannietal., 2018)。自然蜂群中，10日齡工蜂通常從事巢內(nèi)哺育活動，21日齡工蜂主要從事巢外采集活動；同時蜂群中工蜂的勞動分工具有可塑性(Robinson,1992; Behrendsetal., 2008)，當巢內(nèi)缺少適齡哺育蜂時，老年采集蜂可以再次轉(zhuǎn)變?yōu)椴赣?，以維持蜂群的群勢。

哺育蜂哺育行為與其生理健康方面的研究也有涉及，如瓦螨感染哺育蜂后對哺育行為產(chǎn)生許多不利影響，感染的哺育蜂相對于未感染的哺育蜂表現(xiàn)出更差的學習能力(Zannietal., 2018)。已有研究不同日齡條件下哺育蜂、采集蜂學習記憶方面的差異，Behrends和Scheiner(2010)通過測試對比6周的夏季蜜蜂(包括哺育蜂和采集蜂)和6個月的冬季蜜蜂(采集蜂)采集活動對學習表現(xiàn)的影響，發(fā)現(xiàn)冬季蜜蜂的日齡雖然很大，但它們的學習和辨別能力并沒有隨著日齡的增長而下降。

基于蜜蜂嗅覺學習的喙伸反應(yīng)(proboscis extension reflex, PER)已成為訓(xùn)練蜜蜂學習記憶的經(jīng)典方法。借助PER手段，能夠更好地建立哺育蜂與其學習記憶之間的聯(lián)系。目前，關(guān)于蜜蜂學習記憶過程中的相關(guān)基因也有報道。Fiala等(1999)發(fā)現(xiàn)，利用RNA干擾降低蛋白激酶A(protein kinase A, Pka)基因的表達后，導(dǎo)致蜜蜂在訓(xùn)練后24 h長期記憶受到損傷，這表明Pka的激活能夠誘導(dǎo)蜜蜂24 h長期記憶的形成；Dacher和Gauthier(2008)等通過注射拮抗劑發(fā)現(xiàn)，尼古丁受體和一氧化氮合成酶參與了蜜蜂長期記憶的形成；其他基因，如Pka催化亞基基因(Pka-R1,Pka-R2)(Eisenhardtetal., 2001)、腺苷酸環(huán)化酶(adenylyl cyclase, AC)基因(Wachtenetal., 2006)等在其他生物中被報道參與學習記憶，同時也在西方蜜蜂體內(nèi)克隆出它們的同源體，推測這些基因可能參與蜜蜂的學習記憶過程。此外，已報道一些蛋白如鈣調(diào)素(calmodulin, CaM)、鳥苷酸結(jié)合蛋白、蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)、腺苷酸環(huán)化酶(adenylate cyclase, AC)、Ras(rat sarcoma)相關(guān)蛋白、cAMP(環(huán)磷酸腺苷cyclic adenosine monophosphate)-依賴性蛋白激酶A(cAMP-dependent protein kinase A)等與蜜蜂的學習記憶相關(guān)(Nishiyamaetal., 2003; Eisenhardt, 2006; 孟麗峰, 2018)。在蜜蜂嗅覺調(diào)節(jié)過程中，cAMP-依賴性蛋白激酶A的激活對于蜜蜂記憶形成至關(guān)重要，該基因的下調(diào)表達可能削弱蜜蜂條件反應(yīng)的敏感性(Müller, 2000; 蔚添添, 2019)。

蜜蜂個體間的信息交流主要依賴敏銳的嗅覺，其敏銳的嗅覺系統(tǒng)能夠感知蜂群內(nèi)外環(huán)境中化學信號的變化(Conteetal., 2001)。在黑暗的巢房中，哺育蜂能夠辨別饑餓幼蟲與已飼喂幼蟲，對亟待哺育的幼蟲進行精確地飼喂；哺育蜂在人工組建蜂群中同樣也會承擔著清理巢房、釀造蜂糧等工作。這些重要的生理過程均離不開腦部學習記憶相關(guān)網(wǎng)絡(luò)機制的調(diào)控，因此，研究哺育蜂的學習記憶在探討蜜蜂幼蟲生長發(fā)育、維護蜂群穩(wěn)定等方面發(fā)揮重要的意義。目前尚未有對哺育蜂腦部形成學習記憶的分子調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)機制的詳細報道。

在本研究中，我們組建意大利蜜蜂Apismelliferaligustica人工蜂群，收集10日齡哺育蜂、21日齡哺育蜂和21日齡采集蜂；通過氣味聯(lián)想性學習記憶測定意大利工蜂在不同行為和不同日齡條件下學習記憶能力的差異；利用RNA-seq技術(shù)篩選出哺育蜂學習記憶相關(guān)的差異表達基因(differentially expressed genes, DEGs)。本研究旨在利用RNA-seq技術(shù)分析哺育蜂腦部學習中調(diào)控哺育蜂學習行為的相關(guān)DEGs，為深入研究哺育蜂學習行為相關(guān)調(diào)控的分子機制提供重要的理論參考，同時也為提高蜂群中工蜂哺育行為的學習效率提供新的視角。

1 材料與方法

1.1 實驗蜂種

本實驗所用的“蜂強1號”意大利蜜蜂蜂種來自福建農(nóng)林大學動物科學學院(蜂學學院)蜂場(隸屬亞熱帶季風氣候，119°30′E, 26°08′N，海拔600～1 000 m)。

1.2 主要儀器及試劑

體視顯微鏡，冷光源儀器。DEPC水(上海生工生物公司)；SYBR?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(TaKaRa公司)。75%酒精，干冰，碎冰，以及用水和蔗糖自行配制的50%蔗糖溶液。

1.3 標記蜜蜂及收集樣品

實驗所用蜂群為正常健康的5群強群，每群蜂中至少含有2～3張即將出房的封蓋子脾。在組建新的蜂群之前，去除封蓋子脾上的蜜蜂，放于恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度34.5℃，相對濕度60%)中，每隔24 h用不同顏色的記號筆在剛出房的蜜蜂胸部或腹部做好標記，連續(xù)標記10 d，每天標記剛出房工蜂數(shù)目大約為3 000～5 000頭。標記后投入由1頭蜂王、1張蜜粉脾和1張幼蟲脾組建的人工蜂群。

標記的工蜂發(fā)育到第10和21天時，收集頭部伸到有幼蟲巢房且持續(xù)時間超過10 s的工蜂作為哺育蜂；第21天時，在巢門口收集后足花粉筐中載有花粉的外勤蜂，將其作為采集蜂。按照這個要求，收集10日齡哺育蜂、21日齡哺育蜂和21日齡采集蜂。每次收集工蜂后對其進行PER實驗。

1.4 PER實驗

參考Frost等(2012)、Matsumoto等(2012)和蔚添添等(2017)的PER實驗操作，將5～10頭蜜蜂分別裝入小玻璃瓶中，并冰浴處理。待蜜蜂凍暈后，快速固定于蔚添添等(2017)使用的固定裝置中，用50%的蔗糖溶液碰觸蜜蜂觸角確保吻部能自由活動的個體用于后續(xù)實驗。為了減少固定對蜜蜂的影響，將固定后的蜜蜂在恒溫恒濕培養(yǎng)箱(溫度30℃，相對濕度40%)中黑暗放置2 h。PER測定時，先給予1-壬醇氣味刺激(2 s)，然后再給予1-壬醇氣味刺激同時用50%蔗糖溶液碰觸蜜蜂觸角(2 s)，最后糖水獎勵伸喙蜜蜂(2 s)；而對照組氣味學習時，只給予己醇氣味刺激，沒有50%蔗糖碰觸觸角，也沒有糖水獎勵。同時為了排除學習順序?qū)W習的影響，每組蜜蜂依次按照1-壬醇(實驗學習)和己醇(對照學習)、1-壬醇和己醇、己醇和1-壬醇、己醇和1-壬醇、1-壬醇和己醇的順序重復(fù)學習5次，分別記為C1, C2, C3, C4和C5。每次學習行為訓(xùn)練結(jié)束后，間隔10 min，再進行下次學習行為訓(xùn)練。在5次學習中，在前2 s只給予氣味刺激，并記錄蜜蜂伸喙狀況，對1-壬醇氣味刺激表現(xiàn)出喙伸反應(yīng)的蜜蜂，表明已建立1-壬醇氣味與50%蔗糖溶液之間的關(guān)聯(lián)性學習，反之表明未建立。理論上己醇氣味刺激的蜜蜂不出現(xiàn)喙伸反應(yīng)。蜜蜂5次學習完成后，在黑暗環(huán)境下恢復(fù)2 h后測定記憶，1-壬醇氣味刺激后，蜜蜂表現(xiàn)出喙伸反應(yīng)，則表明該蜜蜂對1-壬醇氣味具有記憶能力；反之則表明不具有。

統(tǒng)計每個采樣點樣本在C1, C2, C3, C4和C5的5次重復(fù)實驗中蜜蜂對1-壬醇氣味及2 h后對1-壬醇氣味的伸喙情況，喙伸反應(yīng)率(%)=(發(fā)生喙伸反應(yīng)的蜜蜂數(shù)/受試蜜蜂數(shù))×100。

1.5 哺育蜂腦部學習記憶相關(guān)DEGs的表達水平分析

1.5.1樣品采集：按上述1.4節(jié)PER實驗結(jié)束后，統(tǒng)計每頭蜜蜂5次重復(fù)實驗的學習情況，學會3次及以上個體認為該頭蜜蜂已經(jīng)具有學習能力；1次都沒有學會的認為不具有學習能力。將具有學習能力的10日齡哺育蜂(L_10d)、不具有學習能力的10日齡哺育蜂(NL_10d)、具有學習能力的21日齡哺育蜂(L_21d)、不具有學習能力的21日齡哺育蜂(NL_21d)4組樣品收集，用于后續(xù)RNA-seq。

1.5.2大腦解剖：參考趙元洪等(2014)解剖蜜蜂大腦方法，解剖上述4組樣品的腦部，每組解剖10～15頭蜜蜂的大腦，每組均設(shè)置3個生物學重復(fù)。放入-80℃，待后續(xù)使用。

1.5.3實驗組樣品cDNA文庫構(gòu)建及Illumina測序：L_10d的3個生物學重復(fù)分別為L_10d_1, L_10d_2和L_10d_3; NL_10d的3個生物學重復(fù)分別為NL_10d_1, NL_10d_2和NL_10d_3; L_21d的3個生物學重復(fù)分別為L_21d_1, L_21d_2和L_21d_3; NL_21d的3個生物學重復(fù)分別為NL_21d_1, NL_21d_2和NL_21d_3。委托北京諾禾致源生物有限公司開展總RNA質(zhì)量控制、cDNA文庫構(gòu)建和Illumina測序。

1.5.4哺育蜂學習記憶相關(guān)DEGs：根據(jù)FPKM(fragments per kilobase of exon per million fragments mapped)值法計算每個基因在4組樣本中的表達量。 利用DESeq2軟件分析DEGs，篩選標準為P<0.05(Anders and Huber, 2010)，其中l(wèi)og2Fold change>0和log2Fold change<0分別作為篩選上調(diào)和下調(diào)DEGs的標準。首先分別比較10日齡哺育蜂中具有學習能力(L_10d)和不具有學習能力(NL_10d)個體、21日齡哺育蜂中有學習能力(L_21d)和不具有學習能力(NL_21d)個體、10日齡和21日齡哺育蜂中具有學習能力(L_10和L_21d)的個體、10日齡和21日齡哺育蜂中不具有學習能力(NL_10d和NL_21d)個體之間的DEGs。為了篩選與哺育蜂學習記憶相關(guān)的DEGs，我們利用韋恩圖分析L_10dvsNL_10d和L_21dvsNL_21d之間共有DEGs，同時去除L_10dvsL_21d和NL_10dvsNL_21d這兩組中包含的DEGs，剩余的DEGs便是與哺育蜂學習記憶密切相關(guān)的基因。

1.5.5qPCR分析：在DEGs中隨機選取3個基因。利用Primer Premier 6設(shè)計特異性引物(表1)，qPCR驗證。反應(yīng)體系: SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 5 μL, 上下游引物(2 μmol/L)各1 μL, 模板(500 ng/μL) 2 μL, ddH2O補充至10 μL。PCR程序: 95℃預(yù)變性30 s; 95℃變性5 s, 60℃退火30 s, 共 40個循環(huán); 65℃開始，每5 s上升0.5℃，直至上升到95℃。整個反應(yīng)程序在熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)上進行，按照說明書進行操作。以2-△△Ct法計算哺育蜂腦部DEGs的相對表達量，其中以Actin(GenBank登錄號: NM_001185146.1)作為內(nèi)參基因。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，實驗結(jié)果采用平均值±標準誤表示。蜜蜂的喙伸反應(yīng)率(PER%)的測定采用卡方測驗(χ2test)進行顯著性統(tǒng)計分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。采用單因素方差分析(ANOVA)qPCR中哺育蜂腦部TpnCⅢa，MED23和Pkc基因在不同樣本中表達量的差異顯著性，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

表1 引物列表Table 1 Primer list

2 結(jié)果

2.1 意大利蜜蜂不同日齡工蜂學習記憶能力的比較

隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，10日齡哺育蜂(n=71)和21日齡采集蜂(n=74)經(jīng)5次訓(xùn)練(C1, C2, C3, C4和C5)對1-壬醇氣味的喙伸反應(yīng)率整體呈現(xiàn)上升趨勢，且10日齡哺育蜂經(jīng)過2次訓(xùn)練后的喙伸反應(yīng)率均顯著低于21日齡采集蜂(C2: χ2=17.14,P=0.017<0.05; C3: χ2=24.97,P=0.015<0.05; C4: χ2=32.81,P=0.003 <0.01; C5: χ2=34.28,P=0.000<0.001)(圖1: A)。隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，10日齡哺育蜂和21日齡哺育蜂(n=87)經(jīng)訓(xùn)練后對1-壬醇氣味的喙伸反應(yīng)率逐漸上升，且經(jīng)過5次訓(xùn)練后21日齡哺育蜂的喙伸反應(yīng)率顯著高于10日齡哺育蜂(C1: χ2=3.15,P=0.014<0.05; C5: χ2=35.05,P=0.001<0.01)，表明日齡因素顯著影響哺育蜂的學習能力(圖1: A)。同樣地，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加， 21日齡哺育蜂和21日齡采集蜂經(jīng)訓(xùn)練后對1-壬醇氣味的喙伸反應(yīng)率逐漸上升， 經(jīng)過二次學習后， 21日齡采集蜂的喙伸反應(yīng)率均高于21日齡哺育蜂，但只有在第2次學習后21日齡采集蜂的喙伸反應(yīng)率顯著高于21日齡哺育蜂(C2: χ2=18.39,P=0.04<0.05)，而經(jīng)過第3-5次學習后均沒有顯著差異，表明行為(哺育/采集)沒有顯著影響蜜蜂學習能力(圖1: A)。

圖1 意大利蜜蜂不同日齡工蜂學習(A)和記憶(B)能力的比較Fig. 1 Comparison of learning (A) and memory (B) abilities of Apis mellifera ligustica workers at different day-oldC1-C5: 表示喙伸反應(yīng)訓(xùn)練次數(shù)Number of proboscis extension reflex (PER) training. 紅色星號表示21日齡哺育蜂和21日齡采集蜂喙伸反應(yīng)率差異顯著；綠色星號表示21日齡哺育蜂和10日齡哺育蜂喙伸反應(yīng)率差異顯著；藍色星號表示10日齡哺育蜂和21日齡采集蜂喙伸反應(yīng)率差異顯著。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，星號、雙星號和三星號分別表示P<0.05, P<0.01和P<0.001水平差異顯著(卡方測驗)。Red asterisk indicates significant difference in the PER rate between the 21-day-old nurses and the 21-day-old foragers. Green asterisk indicates significant difference in the PER rate between the 21-day-old and the 10-day-old nurses. Blue asterisk indicates significant difference in the PER rate between the 10-day-old nurses and the 21-day-old foragers. Data in the figure are mean±SE. The asterisk, double asterisk and tri-asterisk indicate significant differences at P<0.05, P<0.01 and P<0.001, respectively (χ2 test).

學習后2 h后，10日齡哺育蜂的記憶能力低于21日齡采集蜂，且兩者之間差異顯著(χ2=29.38,P=0.000<0.001)；21日齡哺育蜂的記憶能力顯著高于10日齡哺育蜂(χ2=28.76,P=0.000<0.001)，而21日齡哺育蜂的記憶能力低于21日齡采集蜂，但兩者之間無差異顯著性，表明日齡是影響哺育蜂記憶能力的重要因素(圖1: B)。

2.2 具有或不具有學習能力的意大利蜜蜂哺育蜂腦部RNA-seq測序數(shù)據(jù)概述

為了全面分析意大利蜜蜂哺育蜂中具有學習能力個體與不具有學習能力個體腦中基因的表達變化，我們根據(jù)PER結(jié)果，將樣本分為4組: L_10d, NL_10d, L_21d, NL_21d，并解剖取其大腦組織，進行RNA-seq測序，有效讀段數(shù)為50 252 002-67 617 298之間，樣本的單一匹配率均在83%以上，Q30值也都在92%以上，說明RNA-seq數(shù)據(jù)質(zhì)量較好，測序數(shù)據(jù)可靠性高(表2)。

表2 具有或不具有學習能力的意大利蜜蜂哺育蜂腦部轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計Table 2 Quality statistics of the brain transcriptome data of Apis mellifera ligustica nurses with or without learning ability

L_10d_1-3: 分別表示10日齡哺育蜂具有學習能力組的3個生物學重復(fù)Three biological replications of 10-day-old nurses with learning ability, respectively; NL_10d_1-3: 分別表示10日齡哺育蜂不具有學習能力組的3個生物學重復(fù)Three biological replications of 10-day-old nurses without learning ability, respectively; L_21d_1-3: 分別表示21日齡哺育蜂具有學習能力組的3個生物學重復(fù)Three biological replications of 21-day-old nurses with learning ability, respectively; NL_21d_1-3: 分別表示21日齡哺育蜂不具有學習能力組的3個生物學重復(fù)Three biological replications of 21-day-old nurses without learning ability, respectively. 下同The same below.

2.3 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)DEGs的篩選及趨勢分析

韋恩圖分析發(fā)現(xiàn)：10日齡哺育蜂腦中具有學習能力和不具有學習能力個體之間(L_10dvsNL_10d)有366個DEGs；21日齡哺育蜂中有學習能力和不具有學習能力個體之間(L_21dvsNL_21d)有876個DEGs；10日齡和21日齡哺育蜂中具有學習能力的個體(L_10dvsL_21d)之間有1 237個DEGs；10日齡和21日齡哺育蜂中不具有學習能力個體(NL_10dvsNL_21d)之間有341個DEGs。L_10dvsNL_10d和L_21dvsNL_21d共有135個DEGs。這135個共有DEGs可能與哺育蜂的發(fā)育日齡、學習記憶等有關(guān)。為了排除發(fā)育日齡的影響，我們?nèi)コ齃_10dvsL_21d和NL_10dvsNL_21d兩組中與135個DEGs也存在交集的47個DEGs，最終我們篩到88個可能與哺育蜂學習記憶密切相關(guān)的基因(圖2: A)。

聚類分析發(fā)現(xiàn)88個DEGs中，在哺育蜂腦中上調(diào)的基因有18個，下調(diào)的基因有70個(圖2: A)，其中高量表達的DEGs集中在NL_10d和NL_21d，而在L_10d和L_21d中高量表達的DEGs相對較少(圖2: B)。在上調(diào)DEGs中發(fā)現(xiàn)編碼肌鈣蛋白基因TpnⅠ和TpnCⅢa，下調(diào)DEGs中發(fā)現(xiàn)Pkc,Pka-R1以及編碼C3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶A的基因Fucta。

2個上調(diào)基因TpnI和TpnCⅢa在L_10d中的表達量顯著性高于NL_10d中的，其中TpnI上調(diào)4倍左右，而TpnCⅢa在L_10d和NL_10d兩組樣本中表達量較高(18

3個下調(diào)基因Pkc,Pka-R1和Fucta在L_10d中的表達量顯著性低于NL_10d中的，Pkc在這2組樣品中的表達量較大(31

此外，我們在上調(diào)DEGs中發(fā)現(xiàn)到一個微量表達的基因Exn(神經(jīng)細胞鳥苷酸置換因子)(3.57

圖2 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)DEGs表達趨勢分析圖Fig. 2 Expression trend of DEGs related to learning and memory in the brain of Apis mellifera ligustica nursesA: 不同樣本間DEGs的韋恩圖Venn diagram of DEGs among different samples; B: 88個DEGs表達量聚類熱圖Expression clustering hot map of 88 DEGs. 圖中上箭頭代表上調(diào)；下箭頭代表下調(diào)。In the figure, the upward arrow means up-regulated, while the downward means down-regulated.

圖3 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)差異表達基因(DEGs)的GO和KEGG功能富集分析Fig. 3 GO and KEGG functional enrichment analysis of differentially expressed genes (DEGs) related to learning and memory in the brain of Apis mellifera ligustica nursesA, B: 分別為上調(diào)和下調(diào)DEGs的GO富集分類 GO enrichment classification of up-regulated and down-regulated DEGs, respectively; C, D: 分別為上調(diào)和下調(diào)DEGs的KEGG富集通路KEGG enrichment pathway of up-regulated and down-regulated DEGs, respectively. 圖中只列出了GO富集功能上排名前30位的通路。Only the top 30 pathways in GO enrichment function were listed in the figure.

2.4 意大利蜜蜂哺育蜂學習記憶相關(guān)DEGs的GO功能注釋分析

DEGs功能主要集中在細胞組分、生物學進程和分子功能。在細胞組分分類中，上調(diào)DEGs(圖3: A)主要富集在細胞骨架和細胞器相關(guān)，如肌動蛋白細胞骨架、細胞骨架組分、細胞內(nèi)非膜結(jié)合細胞器、細胞內(nèi)細胞器組分、細胞器組分等；下調(diào)DEGs(圖3: B)主要富集在細胞器相關(guān)，如細胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器、膜結(jié)合的細胞器、細胞器包膜等。在生物學進程分類中，上調(diào)DEGs(圖3: A)主要富集在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)加工修飾相關(guān)，如Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化；下調(diào)DEGs(圖3: B)富集在轉(zhuǎn)錄、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)生物合成相關(guān)，其中顯著性富集在轉(zhuǎn)錄相關(guān)，如調(diào)控轉(zhuǎn)錄/DNA模板化、調(diào)節(jié)RNA代謝過程、調(diào)控核酸模板轉(zhuǎn)錄、RNA生物合成過程的調(diào)節(jié)等。在分子功能方面，上調(diào)DEGs(圖3: A)主要富集在酶活性、離子結(jié)合相關(guān)，如蛋白激酶活性、金屬離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、陽離子結(jié)合等；下調(diào)DEGs(圖3: B)主要富集在酶活性相關(guān)，如核苷-三磷酸酶活性、焦磷酸酶活性、作用于含磷酸酐中的水解酶活性、磷酸二酯水解酶活性、磷脂酶活性等。

2.5 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)DEGs的KEGG調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析

通過KEGG富集分析，我們發(fā)現(xiàn)上調(diào)表達的DEGs顯著性富集在嘌呤代謝、過氧化物酶體、藥物代謝-其他酶這3個通路(圖3: C)；而下調(diào)表達的DEGs主要富集在吞噬、光轉(zhuǎn)導(dǎo)、AGE-RAGE信號通路、肌醇磷酸代謝、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、Wnt信號通路、蛋白質(zhì)輸出、鞘脂代謝、糖酵解/糖異生、Hippo信號通路、mTOR信號通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、RNA轉(zhuǎn)運，其中吞噬、光轉(zhuǎn)導(dǎo)、AGE-RAGE信號通路為顯著性富集(圖3: D)。

2.6 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)DEGs的qPCR驗證

為驗證測序數(shù)據(jù)的準確性，從88個DEGs中選取2個上調(diào)基因(TpnCⅢa和MED23)和1個下調(diào)基因(Pkc)，結(jié)果顯示這些基因的表達水平的趨勢變化與RNA-seq數(shù)據(jù)中的變化趨勢一致(圖4)，證實了測序結(jié)果的可信性。

圖4 意大利蜜蜂哺育蜂腦中學習記憶相關(guān)差異表達基因(DEGs)的表達分析Fig. 4 Expression analysis of differentially expressed genes (DEGs) related to learning and memory in the brain of Apis mellifera ligustica nursesA, B, C: 分別表示qPCR方法檢測TpnCⅢa, MED23和Pkc在4組樣本腦中的相對表達量Relative expression level of TpnCⅢa, MED23 and Pkc in four brain samples using qPCR, respectively; D, E, F: 分別表示RNA-seq中TpnCⅢa, MED23和Pkc在4組樣本腦中的表達量Expression levels of TpnCⅢa, MED23 and Pkc in RNA-seq in four brain samples, respectively. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤。Data in the figure are mean±SE. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001 (單因素方差分析One-way ANOVA).

3 討論

PER實驗大量用于監(jiān)控殺蟲劑(蔚添添等, 2017)、嗎啡(Chenetal., 2014)等生物化學藥品對蜜蜂的亞致死影響；PER實驗也用于探究不同日齡采集蜂學習記憶能力的差異(Arenas and Farina, 2008)，但鮮有關(guān)于利用PER實驗開展哺育蜂腦部學習記憶相關(guān)基因表達變化的研究報道。本研究利用從人工組建蜂群中收集的10日齡哺育蜂、21日齡哺育蜂、21日齡采集蜂展開PER實驗，對比不同日齡不同行為條件下學習記憶能力的差異；利用RNA-seq技術(shù)篩選出與哺育蜂學習記憶密切相關(guān)的88個DEGs，結(jié)合GO功能富集和KEGG通路富集對這88個DEGs的表達模式也進行了分析。

我們的實驗結(jié)果表明，21日齡采集蜂和21日齡哺育蜂的學習能力均顯著高于10日齡哺育蜂，21日齡采集蜂的學習能力高于21日齡哺育蜂，但無顯著差異；10日齡哺育蜂的記憶能力顯著低于21日齡采集蜂和21日齡哺育蜂，而21日齡哺育蜂的記憶能力低于21日齡采集蜂，但無顯著差異(圖1)。本研究表明21日齡采集蜂的學習和記憶能力明顯高于10日齡哺育蜂，兩者之間的差異不僅由于21日齡采集蜂的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育較10日齡哺育蜂的相對完善之外，也可能由于采集蜂外出采集尋找蜜粉源等巢外飛行經(jīng)驗(劉晰文等, 2014; 王超等, 2014)；除哺育和采集等行為介導(dǎo)產(chǎn)生的學習記憶能力差異外，日齡也會對學習記憶能力產(chǎn)生差異，青年工蜂的學習能力較年長工蜂而言普遍較差(Ray and Ferneyhough, 1997; Laloietal., 2001)，本研究結(jié)果顯示21日齡哺育蜂的學習和記憶能力顯著高于10日齡哺育蜂。

在果蠅Drosophila中，鈣網(wǎng)蛋白在嗅覺系統(tǒng)功能和氣味引導(dǎo)行為中起著關(guān)鍵作用(Stoltzfusetal., 2003)，鈣網(wǎng)蛋白對整合素介導(dǎo)的Ca2+信號結(jié)合而產(chǎn)生的鈣信號傳導(dǎo)和細胞黏附是必需的(Coppolinoetal., 1997)；而Ca2+介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)是蜜蜂蘑菇體學習和記憶的基礎(chǔ)(孟麗峰, 2018)；Garcia等(2009)通過蛋白質(zhì)組學比較分析哺育蜂和采集蜂腦部表達的相關(guān)蛋白，哺育蜂腦部檢測到上調(diào)表達的鈣網(wǎng)蛋白同源體1類似物，這一來自果蠅的同源蛋白很可能在哺育蜂腦部發(fā)揮嗅覺作用。意大利蜜蜂以及其他昆蟲和脊椎動物中嗅小球的高濃度F-肌動蛋白最可能與高度突觸和結(jié)構(gòu)有關(guān)(R?ssleretal., 2002; Grohetal., 2006)，而突觸的變化很可能在級型分化和日齡特異性的行為中起到因果作用(Garciaetal., 2009)。本研究在上調(diào)DEGs雖未發(fā)現(xiàn)鈣網(wǎng)蛋白相關(guān)基因的表達，但在其GO分類中發(fā)現(xiàn)TpnCIIIa富集在Ca2+結(jié)合一類中，TpnI富集在肌動蛋白細胞骨架一類中，而TpnCIIIa和TpnI這兩個基因在上調(diào)DEGs中的表達量相對較高，它們在L_10d中的表達量顯著性高于NL_10d中的，在L_21d中的表達量顯著性高于NL_21d中的(圖4: A)。TpnI和TpnC都屬于肌鈣蛋白復(fù)合物的組分，TpnCIIIa屬于TpnC基因型組中的一類基因型；TpnC感知細胞內(nèi)鈣水平的增加并誘導(dǎo)原肌球蛋白-肌鈣蛋白復(fù)合物中的構(gòu)象變化，從而引發(fā)收縮反應(yīng)(Herranzetal., 2005)。學習和記憶過程需要將細胞外刺激轉(zhuǎn)化為細胞內(nèi)信號(Diaoetal., 2018)，我們推測哺育蜂腦部TpnCIIIa介導(dǎo)Ca2+結(jié)合而產(chǎn)生鈣信號傳導(dǎo)激發(fā)其學習行為，同時TpnI基因介導(dǎo)的相關(guān)肌動蛋白，如F-肌動蛋白等，進一步改變哺育蜂腦部神經(jīng)元細胞相關(guān)的突觸結(jié)構(gòu)變化，產(chǎn)生哺育蜂不同日齡的學習差異現(xiàn)象；肌鈣蛋白在哺育蜂學習過程中的功能可能類似于鈣網(wǎng)蛋白，可以通過動員細胞內(nèi)外與聯(lián)想記憶相關(guān)的Ca2+，從而促進哺育蜂的學習記憶能力。學習記憶過程需要把胞外刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號，這一過程需要信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)，而Ras相關(guān)蛋白與蜜蜂的學習記憶相關(guān)(王子龍等, 2017; 孟麗峰, 2018)。上調(diào)DEGs中發(fā)現(xiàn)Exn在GO分類中富集在信號傳導(dǎo)功能一類上，其中包括Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；Exn介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程在學習記憶形成過程可能發(fā)揮重要促進作用。據(jù)此，我們推測Ca2+與細胞內(nèi)的相關(guān)靶蛋白結(jié)合，在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)條件催化下，激活蛋白質(zhì)激酶，促進蛋白質(zhì)酶磷酸化，從而刺激細胞收縮，引發(fā)學習行為。

cAMP/PKA/CREB信號通路與學習記憶之間有著重要的聯(lián)系，cAMP與PKA結(jié)構(gòu)亞基上的位點結(jié)合，具有催化活性的PKA調(diào)節(jié)亞基解離并進入核內(nèi)，磷酸化CREB從而啟動下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，合成與學習記憶相關(guān)的蛋白(楊夏等, 2011)。學習記憶過程需要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)胞外刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)榘麅?nèi)信號，長期記憶的形成涉及多條信號傳遞途徑，其中包括cAMP-PKA途徑，cAMP濃度升高激活PKA，是激素調(diào)控細胞代謝或基因表達的主要途徑(王子龍等, 2017)；cAMP能夠激活蜜蜂腦部的PKA，從而調(diào)控與蜜蜂學習記憶相關(guān)蛋白質(zhì)的合成(Menzel, 1999)。磷酸二酯酶4是cAMP的一種特異性水解酶，其可以調(diào)節(jié)cAMP/PKA/CREB信號通路，磷酸二酯酶4能夠調(diào)節(jié)近端cAMP觸發(fā)的活性，也能夠調(diào)節(jié)遠端cAMP活性以及PKA催化亞基向核內(nèi)的遷移，導(dǎo)致細胞內(nèi)參與學習記憶相關(guān)的蛋白質(zhì)不能合成(楊夏等, 2011; O′Banionetal., 2019)。磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)可激活下游PKA和PKC通路，通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程來調(diào)節(jié)學習和記憶能力(孟麗峰, 2018)；光傳導(dǎo)通路中的G-蛋白耦聯(lián)受體通路也是蜜蜂蘑菇體學習和記憶的基礎(chǔ)，GTPase激活蛋白GAP，增強小G蛋白的GTP酶活性，催化GTP水解為GDP，使小G蛋白失活，是負調(diào)控因子(孟麗峰, 2018)。我們在下調(diào)DEGs的KEGG通路中也發(fā)現(xiàn)Pkc和Fucta富集的磷脂酰肌醇信號；Pkc和Arp1均顯著性富集在與學習記憶相關(guān)的光傳導(dǎo)通路上，GO分類中LOC408782和LOC408388富集的GTPase活性可能增強光傳導(dǎo)通路中GTPase的負調(diào)控強度。PKA和PKC兩種激酶在蜜蜂學習記憶中發(fā)揮重要作用，而在具有學習能力的哺育蜂腦組織中Pkc和Pka-R1下調(diào)，暗示它們在哺育蜂學習過程中可能發(fā)揮負調(diào)控的作用。GO分析中發(fā)現(xiàn)Fucta富集在磷酸二酯水解酶活性這一功能上，推測在具有學習能力的哺育蜂腦組織中富集在磷酸二酯水解酶的相關(guān)基因下調(diào)表達，從而促進了細胞內(nèi)與學習記憶相關(guān)蛋白合成，提高了具有學習能力哺育蜂的學習能力(Menzel, 1999; 楊夏等, 2011)。

我們通過RNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)TpnCIIIa,TpnI,Exn,Pkc和Pka-R1等在哺育蜂腦部差異表達，這為后續(xù)深入研究蜜蜂學習記憶相關(guān)分子機制方面提供理論參考價值。