結(jié)腸癌組織中TBX3及增殖、凋亡、自噬相關(guān)基因表達(dá)觀察

董明杰，周艷，段沫，高慶敏，趙建輝

1 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，石家莊050000；2 正定縣人民醫(yī)院

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療和基因治療為惡性腫瘤患者帶來了新的希望，有效生物標(biāo)志物也在惡性腫瘤的早、中期檢測及預(yù)后臨床管理中起著重要作用。結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，由于其發(fā)病較為隱匿、沒有特異性癥狀，部分結(jié)腸癌患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即處于中、晚期階段，因此有必要尋找新的生物標(biāo)志物，從而更準(zhǔn)確、全面的開展結(jié)腸癌患者精準(zhǔn)治療。TBX基因家族是調(diào)控發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，TBX3基因是TBX基因家族成員之一[1,2]。研究[3～5]顯示，TBX3基因在細(xì)胞惡變及腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要作用。研究[4,6]表明，TBX3基因在乳腺癌、胰腺癌、宮頸癌、肝癌和肺癌等腫瘤組織中表達(dá)異常增高。Shan等[7]報(bào)道，結(jié)腸癌組織中TBX3蛋白的表達(dá)明顯高于正常組織。但TBX3調(diào)節(jié)結(jié)腸癌發(fā)展的特定分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。本研究觀察了結(jié)腸癌組織中TBX3及增殖、凋亡、自噬相關(guān)基因的表達(dá)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年10月～2018年9月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院收治并接受手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者68例，男41例、女27例，平均年齡(54.86±12.05)歲，術(shù)中留取癌組織及癌旁組織標(biāo)本，分別記為觀察組、對照組，各組標(biāo)本在-80 ℃條件下保存?；颊咝g(shù)前均未行放化療或靶向治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 試劑及引物 TBX3基因小鼠抗人單克隆抗體、內(nèi)參β-actin購自Santa Cruz公司，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)基因、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)基因、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP-1)基因、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因-2(Bcl-2)基因、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)基因、半胱天冬酶-3(Caspase-3)基因、存活蛋白(Survivin)基因、肽基脯氨酰順反異構(gòu)酶1(Pin1)基因、神經(jīng)元衍生的孤核受體(NOR1)基因、自噬基因同源家族成員(ARHI)基因、自噬調(diào)節(jié)蛋白(Beclin1)基因、組織蛋白酶-D(Cathepsin-D)基因引物及內(nèi)參基因GAPDH引物由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.3 觀察組、對照組TBX3蛋白的檢測 采用Western blotting法。取結(jié)腸癌組織及癌旁組織100 mg，細(xì)胞裂解液裂解，Bradford法測定組織細(xì)胞總蛋白，在50 μg總蛋白液中加入聚丙烯酰胺凝膠緩沖液，水浴3～5 min進(jìn)行蛋白變性，上樣、凝膠電泳分離，半干法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%牛奶室溫封閉、加入一抗孵育過夜，洗膜后用辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗室溫孵育反應(yīng)，充分洗膜后顯影曝光，對條帶進(jìn)行吸光度掃描，以TBX3/β-actin比值表示TBX3蛋白的相對表達(dá)量。以觀察組TBX3蛋白相對表達(dá)量的中位數(shù)為界，將其分為高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組。

1.4 觀察組、對照組TBX3基因和高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組增殖相關(guān)基因(PCNA基因、MMP-2基因、MMP-9基因、TIMP-1基因)、凋亡相關(guān)基因(Bcl-2基因、Bax基因、Caspase-3基因、Survivin基因、Pin1基因、NOR1基因)、自噬相關(guān)基因(ARHI基因、Beclin1基因、Cathepsin-D基因)mRNA的檢測 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取結(jié)腸癌組織及癌旁組織100 mg，PCR試劑盒提取總RNA，Nanodrop 2000分光光度計(jì)鑒定其濃度和純度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行Real time PCR擴(kuò)增。受檢基因PCR反應(yīng)引物序列見表1。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 min，95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、70 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。以2-ΔΔCt表示目的基因mRNA的相對表達(dá)量，比較高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組增殖、凋亡、自噬相關(guān)基因mRNA的相對表達(dá)量。

表1 受檢基因引物序列

2 結(jié)果

2.1 觀察組、對照組TBX3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 觀察組TBX3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量分別為3.62±0.77、0.66±0.13，對照組TBX3 mRNA和蛋白相對表達(dá)量分別為0.92±0.14、0.18±0.03，兩者相比，P均<0.05。以觀察組TBX3蛋白相對表達(dá)量的中位數(shù)為界進(jìn)行分組，其中高TBX3表達(dá)組34例、低TBX3表達(dá)組34例。

2.2 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組增殖相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組增殖相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較見表2。由表2可知，高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)，TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達(dá)組MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量均高于低TBX3表達(dá)組(P均<0.05)，TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量低于低TBX3表達(dá)組(P<0.05)。

表2 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組增殖相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達(dá)組相比，﹟P<0.05。

2.3 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較見表3。由表3可知，高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組Bcl-2、Pin1 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組(P均<0.05)，Bax、Caspase-3、Survivin、NOR1 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達(dá)組Bcl-2、Pin1 mRNA相對表達(dá)量均低于低TBX3表達(dá)組(P均<0.05)，Bax、Caspase-3、Survivin、NOR1 mRNA相對表達(dá)量均高于低TBX3表達(dá)組(P均<0.05)。

表3 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組凋亡相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達(dá)組相比，﹟P<0.05。

2.4 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組自噬相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組自噬相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較見表4。由表4可知，高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組ARHI、Beclin1 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組(P均<0.05)，Cathepsin-D mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)；高TBX3表達(dá)組ARHI、Beclin1 mRNA相對表達(dá)量均低于低TBX3表達(dá)組(P均<0.05)，Cathepsin-D mRNA相對表達(dá)量高于低TBX3表達(dá)組(P<0.05)。

表4 高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組、對照組自噬相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組相比，﹡P<0.05；與低TBX3表達(dá)組相比，﹟P<0.05。

3 討論

TBX基因家族也稱T-box家族，是調(diào)控發(fā)育相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因家族，根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能的相似度分為5個(gè)亞家族，即Brachyury、T-brain、TBX1、TBX2和TBX6亞家族，其中TBX2亞家族由TBX3基因與TBX2基因共同組成。不同的T-BOX亞家族成員有不同的組織表達(dá)特異性，在胚胎發(fā)育調(diào)控及維持干細(xì)胞功能過程具有重要功能[8]。

TBX3在心、腎、肺、肝、骨骼肌、胰腺和乳腺等多種器官均有表達(dá)。研究[9,10]發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、肝癌、胰腺癌、黑色素瘤、肉瘤和宮頸癌等多種癌癥患者的腫瘤組織中TBX3高表達(dá)，參與腫瘤發(fā)生的多種生物學(xué)行為，其中TBX3在乳腺癌方面的研究相對較多。研究[11，12]表明，TBX3不但參與了乳腺的發(fā)育調(diào)控，還參與了乳腺癌的形成和進(jìn)展，對乳腺癌患者治療方案的制訂及預(yù)后的判斷有重要意義。

全基因組薈萃分析[13]指出，TBX3可能參與了結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。本研究中，我們采用Western blotting方法檢測結(jié)腸癌組織和癌旁組織中TBX3蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明結(jié)腸癌組織種TBX3蛋白相對表達(dá)量明顯高于癌旁組織，提示TBX3蛋白可能參與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展。我們以結(jié)腸癌組織中TBX3蛋白相對表達(dá)量的中位數(shù)為界，對結(jié)腸癌患者進(jìn)行二次分組，分為了高TBX3表達(dá)組和低TBX3表達(dá)組，進(jìn)一步采用RT-PCR方法檢測增殖、凋亡、自噬相關(guān)基因mRNA的表達(dá)，結(jié)果表明高TBX3表達(dá)組、低TBX3表達(dá)組PCNA、MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量均高于對照組，TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量均低于對照組；高TBX3表達(dá)組MMP-2、MMP-9 mRNA相對表達(dá)量均高于低TBX3表達(dá)組，TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量低于低TBX3表達(dá)組，提示了結(jié)腸癌患者增殖基因異常表達(dá)，TBX3蛋白高表達(dá)可加劇增殖基因表達(dá)紊亂，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。研究[14～16]顯示，Bax、Caspase-3、Survivin屬于凋亡相關(guān)調(diào)控基因，表達(dá)異?？梢种颇[瘤細(xì)胞凋亡，促使細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化。研究[17]發(fā)現(xiàn)，抑制Pin1基因表達(dá)可抑制肺癌、宮頸癌、結(jié)腸癌等細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果提示，TBX3蛋白高表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡異常。自噬相關(guān)基因與腫瘤的關(guān)系密切，ARHI、Beclin1在惡性腫瘤中表達(dá)下降[18,19]，Cathepsin-D呈現(xiàn)高表達(dá)，并與腫瘤局部浸潤程度呈正相關(guān)[20]。本研究結(jié)果也證明了結(jié)腸癌患者ARHI、Beclin1 mRNA表達(dá)降低，Cathepsin-D mRNA表達(dá)升高，且高TBX3表達(dá)組與低TBX3表達(dá)組也有顯著差異，說明高表達(dá)的TBX3蛋白可進(jìn)一步破壞自噬基因的正常表達(dá)，增加結(jié)腸癌惡性程度。

綜上所述，TBX3基因和蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，結(jié)腸癌組織中增殖、凋亡、自噬相關(guān)基因的表達(dá)與TBX3蛋白的高表達(dá)有關(guān)，TBX3基因有望成為結(jié)腸癌的新標(biāo)志物。