lncRNA AB07361在冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清中的表達及意義*

王延震，李 炯，甘義榮，寇宗科，張云龍，梁天香，冒 銳，謝定雄△

1甘肅省心血管病研究所，蘭州 7300502蘭州大學基礎醫(yī)學院，蘭州 730000

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease，CAD)又稱為缺血性心臟病、冠心病，是嚴重的心血管疾病之一，亦為人類重要死亡原因之一[1-2]。僅2015年世界范圍內有1.1億的新發(fā)冠心病患者，死亡高達890萬人。目前我國冠心病患者約有1100萬人，其病死率呈上升趨勢[3]。動脈粥樣硬化為多數(shù)心血管疾病的病理基礎，受遺傳、免疫紊亂、慢性炎癥及脂質代謝異常等因素影響，其病程涉及脂質在血管內膜沉積、內皮細胞受損、血小板和白細胞(單核細胞)粘附、侵襲伴平滑肌細胞和膠原纖維增生、泡沫細胞形成等。CAD的發(fā)病機制較為復雜，其危險因素包括高血壓、冠心病家族史、高脂血癥、吸煙、肥胖等[4]。相關研究表明，胰島素樣生長因子2B mRNA(IGF2B mRNA)通過結合蛋白參與動脈粥樣硬化炎癥反應，而長鏈非編碼RNA(lncRNA)已被證實可能具有調控IGF2B mRNA蛋白表達的作用，本研究旨在探討lncRNA AB07361在CAD患者血清中的表達及其臨床意義。以期為明確影響CAD病理生理進程的相關調控機制，對CAD患者實行早診斷，有效降低其病死率而提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2017年3月～2019年6月于甘肅省心血管病研究所行冠狀動脈CT或冠脈造影符合納入條件的CAD患者96例為CAD組，其中男性41例、女性55例，平均年齡(62.73±10.41)歲；同時選取同期住院的非CAD患者96例為對照組，其中58例女性、38例男性，平均年齡(63.12±10.64)歲?；颊呔性煊盎蚬诿}CT檢查，對右冠狀動脈、左前降支、左回旋支、左主干等主要血管至少予以3處多體位測定，若結果顯示狹窄超過直徑50%的血管>1支，即可確診為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(CAD)。排除腫瘤患者、急慢性感染性疾病者、嚴重肝腎功能損壞者、周圍血管性疾病及血液系統(tǒng)疾病患者、瓣膜性心臟病患者、心律失常者。此研究經(jīng)我所倫理委員會批準通過，受試者均知情并簽署同意書。兩組患者血糖、血脂、血壓水平、體重、身高、年齡、性別等一般臨床資料具有可比性(表1)。

1.2 血液樣品采集

受試者清晨7：00空腹抽肘靜脈血7 mL，并將血液樣本置于EDTA抗凝管中，4℃下3000 r/min離心15 min，取上清液備用。

1.3 應用測序方法對9p21基因區(qū)域3種單核苷酸多態(tài)性進行分型

提取受試血液樣本基因組DNA，PCR擴增9p21含3種單核苷酸(rs1333049、rs564398、rs2811712)多態(tài)性位點的區(qū)域，應用測序方法分型。在20 μL的PCR擴增體系中，加入1 μL基因組DNA后在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設置程序：95℃變性15 min；95℃30 s、56℃1 min、72℃1 min，35個循環(huán)；72℃延伸7 min。在PCR擴增產(chǎn)物中加入等體積ddH2O稀釋，作為連接反應的模板，在1.5 mL Eppendorf離心管中分別加入100 μL buffer(×10)，100 μL Probe Mix，5 μL連接酶，695 μL去離子水?；靹蚝笕? μL分裝在200 μL的PCR反應管中，最后再加入1 μL PCR反應產(chǎn)物，在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems9600上設置程序：95℃變性2 min；94℃30 s、56℃1 min，35個循環(huán)；50℃2 min。將PCR反應管放入PCR儀中進行連接反應，各取1 μL LDR連接產(chǎn)物與1 μL ABI GS-500ROX熒光標記分子量標準和1 μL去離子甲酰胺上樣液混合，95℃加熱變性2 min，冰中驟冷，在5%聚丙烯酰胺和5 mol/L尿素中3000 V電泳2.5 h，應用GENESCAN672軟件對數(shù)據(jù)收集、泳道線校正、遷移片段大小測量和矯正內在分子量標準，應用Genemapper軟件進行數(shù)據(jù)分析和基因分型。

1.4 qRT-PCR法測定外周血中l(wèi)ncRNA AB07361等的表達

在人類基因組上，AB07361、CDKN2A、CDKN2B基因在9p21染色體上連鎖排列，是細胞轉化生長因子的調控區(qū)域，因此本次研究從GenBank獲得AB07361、CDKN2A、CDKN2B、GAPDH序列，采用Primer 6.0軟件設計引物(表2)。建立10 μL反應體系：cDNA 2 μL，ddH2O 1 μL，上下游引物(由武漢金凱瑞公司合成)各1 μL，2×SYBR GREEN Master Mix 5 μL。設置RT-PCR反應條件為：95℃反應30 s；95℃反應10 s、60℃反應30 s，35個循環(huán)。目的基因表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

表2 lncRNA各引物序列Table 2 Primer sequences of lncRNA

1.5 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)處理采用SPSS 23.0軟件和GraphPad Prism系統(tǒng)，兩組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗。計數(shù)資料以百分比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者外周血中l(wèi)ncRNA AB07361表達水平比較

qRT-PCR結果表明，在CAD患者外周血中l(wèi)ncRNA AB07361的相對表達量顯著高于非CAD患者，(4.352±0.223)vs.(1.623±0.145)，P<0.05。

2.2 lncRNA AB07361表達水平對CAD診斷的效能

ROC分析lncRNA AB07361的表達見圖1，當Cut-off值為3.026，曲線下面積(AUC)值為0.883時，診斷CAD的特異度為85%，靈敏度為75%。

2.3 比較CAD與9p21區(qū)域多態(tài)性單核苷酸的相關性

分析測定了對照組及CAD組9p21基因區(qū)域3種單核苷酸rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因分布情況。結果表明：在兩組受試者中rs1333049、rs564398、rs2811712的等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。

2.4 lncRNA AB07361表達與rs1333049等位基因G頻率的關聯(lián)性

對CAD組lncRNA AB07361(外顯子17-18)、lncRNA AB07361(外顯子1-2)與rs1333049等位基因G頻率的相關性進行分析，發(fā)現(xiàn)兩者均呈正相關(r=0.341，0.313，均P<0.05)，見圖2。

2.5 lncRNA AB07361表達與CDKN2A、CDKN2B表達的關聯(lián)性

分別對冠心病組lncRNA AB07361表達與CDKN2B、CDKN2A表達的相關性進行分析，結果顯示：lncRNA AB07361(外顯子17-18)表達與CDKN2A的表達呈正相關(r=0.548，P<0.01)，而與CDKN2B的表達無相關性；lncRNA AB07361(外顯子1-2)與CDKN2A、CDKN2B表達均呈正相關(r=0.652，0.518，均P<0.05)，見圖3。

圖1 ROC分析lncRNA AB07361的表達Fig.1 Expression of lncRNA AB07361 by ROC analysis

表3 兩組患者單核苷酸等位基因頻率比較[例(%)]Table 3 Comparison of single nucleotide allele frequencies between the two groups[n(%)]

圖2 rs1333049等位基因G頻率與lncRNA AB07361表達的相關性分析Fig.2 Correlation analysis of rs1333049 allele frequency G and lncRNA AB07361 expression

圖3 lncRNA AB07361與CDKN2A、CDKN2B相關性分析Fig.3 Correlation analysis between lncRNA AB07361 and CDKN2A，CDKN2B

3 討論

為提高冠心病患者早期診斷率，實現(xiàn)早期治療，改善患者臨床癥狀，尋找新的生物標志物和治療靶點成為最新研究方向[5]。lncRNA是擁有200個以上核苷酸的RNA分子，其可從轉錄及轉錄后多層面地對基因表達進行調控，同時影響信號分子通路，因而在分子生物學領域備受關注[6]。lncRNA較mRNA表達水平低，但諸多證據(jù)表明，lncRNA在胚胎干細胞發(fā)育和分化過程中起關鍵作用。全基因組研究顯示，lncRNA為細胞特異性，可反映表觀遺傳學的作用[7]。lncRNA參與了血管生成與功能、炎癥反應、斑塊的形成、脂質沉積、血管平滑肌細胞的遷移和增殖等調節(jié)過程，而冠心病的發(fā)生、發(fā)展及預后則與其異常表達相關。

單核苷酸在染色體9p21區(qū)域中表達極為豐富，其通常與疾病密切相關，臨床中包括動脈粥樣硬化性疾病、心肌梗死、顱內動脈瘤等在內的心血管疾病，以及內分泌代謝疾病如2型糖尿病等均與該區(qū)域有關[8-9]。同時它還與皮膚痣、黑色素瘤、牙周炎和阿爾茨海默病、白血病和青光眼等遠緣病因的疾病亦存在關聯(lián)[10-11]。全基因組關聯(lián)研究(GWAS)目前也已確定染色體9p21區(qū)域遺傳變異的基因與心血管疾病的發(fā)生具有密切關聯(lián)[12]。鑒于此，本研究對CAD組及對照組患者9p21區(qū)域的rs1333049、rs564398和rs2811712等3種單核苷酸表達水平進行檢測，分析了其不同基因型在CAD患者中的差異性表達。結果表明：在兩組受試者中rs1333049、rs2811712與rs564398等位基因頻率差異均無統(tǒng)計學意義。

近期研究表明，lncRNA可通過調節(jié)基因的增強子和啟動子對周圍基因表達進行調節(jié)，可以從轉錄調控及轉錄后調控、表觀遺傳學等多個方面調控基因表達，從而對細胞的增殖、凋亡和損傷、自噬予以調節(jié)，以此參與疾病的發(fā)生和發(fā)展過程[13-14]。

本研究結果顯示：① lncRNA AB07361在CAD患者外周血中的相對表達量顯著高于非CAD患者。采用ROC分析，AUC為0.883，以此判斷l(xiāng)ncRNA AB07361可作為輔助診斷CAD的分子標志物，其診斷CAD的特異度為85%，靈敏度為75%時，Cut-off值為3.026。但本研究對象局限于單一地區(qū)的漢族人群，且所納入樣本量偏少，我們將在后續(xù)的研究中擴大研究樣本量，進而明確是否可以將lncRNA AB07361作為診斷CAD的分子標志物。②冠心病患者lncRNA AB07361(外顯子17-18)、AB07361(外顯子1-2)與rs1333049等位基因G頻率均呈正相關。③lncRNA AB07361(外顯子17-18)與CDKN2A的表達呈正相關，lncRNA AB07361(外顯子1-2)與CDKN2A、CDKN2B表達呈正相關。

總之，lncRNA AB07361或通過調控CDKN2A、CDKN2B的表達而影響CAD的發(fā)生發(fā)展，而lncRNA AB07361的表達可能受染色體9p21區(qū)域單核苷酸rs1333049表達的影響。lncRNA AB07361或可成為早期鑒別和診斷CAD的分子標志物，在臨床上具有良好應用前景，但其具體機制仍需進一步深入研究。