電感耦合等離子體質(zhì)譜測定乙二胺二氯合鈀給藥后人橫紋肌瘤細胞中鈀的含量和分布*

王 媛，劉德曄，吉文亮，劉華良

江蘇省疾病預(yù)防控制中心理化檢驗所，南京 210009

鈀(Ⅱ)配合物擁有與鉑(Ⅱ)配合物一致的平面四邊形結(jié)構(gòu)，化學(xué)性質(zhì)相近，因此鈀(Ⅱ)也具有抗癌作用[1-4]。與鉑(Ⅱ)藥物類似，鈀(Ⅱ)配合物殺傷腫瘤細胞的機制為：鈀(Ⅱ)藥物進入細胞后發(fā)生水解生成活性鈀(Ⅱ)，部分活性鈀(Ⅱ)進入細胞核與DNA中富含鳥嘌呤的片段發(fā)生反應(yīng)[5-6]，生成穩(wěn)定的分子鍵，破壞DNA復(fù)制功能，當(dāng)DNA功能被破壞到無法修復(fù)時細胞發(fā)生凋亡[7-8]。雖然目前未有鈀(Ⅱ)藥物進入臨床應(yīng)用，但這類藥物的研發(fā)依然保持一定熱度，并且人們發(fā)現(xiàn)相當(dāng)數(shù)量的鈀(Ⅱ)配合物細胞學(xué)實驗效果優(yōu)于順鉑[9-10]，但是這類細胞學(xué)實驗往往只關(guān)注藥物的IC50值和給藥后細胞形態(tài)的變化，并未研究細胞內(nèi)鈀的含量和分布特點，具有一定的局限性。研究細胞內(nèi)鈀的含量和分布特點可以深入了解藥物在細胞內(nèi)的分布，進一步指導(dǎo)設(shè)計穿膜效率更高或與DNA結(jié)合率更高的含鈀(Ⅱ)藥物，具有深遠意義。

結(jié)構(gòu)簡單的鈀(Ⅱ)化合物可減少由復(fù)雜配體帶入的不確定干擾因素，在研究藥物機理方面具有較大優(yōu)勢[5-6]。乙二胺二氯合鈀([Pd(en)]Cl2)結(jié)構(gòu)簡單，它的毒理性質(zhì)可代表鈀(Ⅱ)本身的毒性。本研究表明乙二胺二氯合鈀給藥后細胞內(nèi)的鈀含量為ng級，與DNA化合的鈀為pg級，在如此低濃度和復(fù)雜基質(zhì)情況下原子吸收、原子發(fā)射、電化學(xué)等分析手段往往不能得到良好的效果。目前，電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)作為分析微量和痕量元素的強有力手段，廣泛應(yīng)用于水質(zhì)、食品、環(huán)境、生物樣本等領(lǐng)域的分析中[11-13]，與液相色譜聯(lián)用后還可用于元素的形態(tài)和價態(tài)分析[14-15]，該儀器測定方法靈敏度和準確度高，適用于本研究。本研究使用ICP-MS測定給藥后細胞內(nèi)鈀(Ⅱ)的含量以及與DNA化合的鈀(Ⅱ)含量，得出細胞內(nèi)鈀(Ⅱ)的分布、細胞鈀(Ⅱ)攝入量與給藥劑量的關(guān)系及細胞DNA可承受鈀(Ⅱ)的最大值，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(安捷倫，美國)，Qubit DNA熒光檢測儀(Life Technologies，美國)，TF100-F顯微鏡(尼康，日本)，DK-S24水浴鍋(上海精宏，中國)，Milli-Q純水儀(美國)，高純硝酸(默克，德國)，1000 mg/L鈀單標和镥單標(Spex，美國)，乙二胺二氯合鈀(Sigma，美國)，DMEM培養(yǎng)液(Gibco/Invitrogen，美國)，血和組織DNA提取試劑盒(Qiagen，德國)，人橫紋肌瘤細胞株(Human RD，中科院上海生命科學(xué)研究院)。

1.2 細胞培養(yǎng)及樣品前處理

乙二胺二氯合鈀不溶于水，可緩慢溶解于培養(yǎng)液中。分別用培養(yǎng)液配制含乙二胺二氯合鈀0、20、35、50、60、70、80、90、100 mg/L溶液作為加藥培養(yǎng)液。

細胞復(fù)蘇后接種于12孔板中加入1.0 mL未加藥培養(yǎng)液，48 h后細胞鋪滿12孔板，此時將培養(yǎng)液移除再加入1.0 mL含有不同濃度的加藥培養(yǎng)液。加藥完成后將細胞放置于37℃、5%CO2的恒溫箱中培養(yǎng)，48 h后將細胞取出在顯微鏡下觀察形態(tài)。后移除加藥培養(yǎng)液，再分別用1 mL培養(yǎng)液洗滌5次，將細胞表面殘留藥物充分洗去。

測定細胞內(nèi)鈀含量的樣品制備：在上述細胞培養(yǎng)孔中加入0.25 mL純水，用移液槍頭仔細將底部的細胞刮下收集于2 mL塑料離心管中，加入0.5 mL硝酸密封，100℃水浴消解20 min后冷卻，定容至2.0 mL待測，測定細胞內(nèi)鈀含量使用的鈀標準曲線范圍為1.00～10.00 ng/mL，在線內(nèi)標為5 ng/mL镥，相關(guān)系數(shù)r> 0.999，檢出限0.005 ng/mL。

測定細胞DNA化合鈀的樣品制備：按照DNA提取試劑盒的標準操作程序操作后得到0.2 mL DNA溶液，取5 μL測定DNA含量，余下溶液中加入0.5 mL硝酸密封，100℃水浴消解20 min后冷卻，定容至2.0 mL待測，測定DNA化合鈀使用的鈀標準曲線范圍為0.01～0.50 ng/mL，在線內(nèi)標為0.5 ng/mL镥，相關(guān)系數(shù)r> 0.995，檢出限0.005 ng/mL。

1.3 儀器參數(shù)

自然界中鈀有5種同位素，其中豐度最高的為鈀-106，本實驗選取鈀-106作為測定同位素，實驗中空白離子強度平均計數(shù)小于1 cps。儀器主要條件如表1所示。

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜條件Table 1 ICP-MS experimental condition

2 結(jié)果

2.1 細胞內(nèi)鈀含量的測定及細胞形態(tài)觀察

細胞在48 h內(nèi)逐步攝入乙二胺二氯合鈀形成蓄積，蓄積到一定程度后損害細胞DNA，當(dāng)DNA受到不可逆損傷后細胞凋亡。細胞內(nèi)鈀含量與給藥濃度關(guān)系及細胞形態(tài)變化如圖1所示。

圖1 細胞內(nèi)鈀含量與給藥濃度的關(guān)系(A)及不同給藥濃度下細胞形態(tài)(B)Fig.1 Relationship between intracellular Pd content and Pd administration concentration(A)，and observation of cells before harvest(B)

從圖1A可看出，隨著藥物濃度的增加細胞內(nèi)鈀含量不斷上升，但上升的速率不均勻，在低濃度時(小于50 mg/L)細胞內(nèi)鈀含量以較慢速率上升，在中等給藥濃度時細胞內(nèi)鈀含量以較快速率上升(50～80 mg/L)，在高濃度時細胞發(fā)生了凋亡，收集到的細胞很少，因此測得的鈀含量急劇下降。從圖1B中可看出，低濃度時細胞形態(tài)均勻完好，處于“健康”狀態(tài)具有正常的細胞功能；中等濃度時隨著濃度的增加不斷有凋亡的細胞上浮，說明細胞功能部分受損，處于“亞健康”狀態(tài)，細胞膜通透性增加，藥物進入細胞比例升高；高濃度時細胞功能喪失發(fā)生大面積凋亡。此處需說明，給藥濃度90 mg/L時顯微鏡下細胞形態(tài)較好，但此時細胞貼壁能力幾乎消失，在移除加藥培養(yǎng)液及清洗過程中大量細胞漂浮損失，因此可認為此時細胞處于“接近死亡”狀態(tài)。

根據(jù)計算得出，培養(yǎng)液中0.02%～0.05%的鈀被細胞攝入，其中低濃度時攝入比例略低，高濃度時攝入比例略高，總體來說細胞的攝入效率不高，因此乙二胺二氯合鈀不是高效的抗癌藥物，但是可作為鈀(Ⅱ)藥物的研究模型。

2.2 DNA含量的測定及DNA化合鈀含量的測定

與鉑(Ⅱ)類藥物相同，鈀(Ⅱ)類化合物也是以細胞核內(nèi)DNA作為主要作用靶點，使DNA變性從而誘導(dǎo)細胞凋亡。因此測定DNA化合鈀的含量可揭示DNA的修復(fù)能力和細胞對鈀(Ⅱ)的耐受程度，如圖2所示。

圖2 DNA化合鈀含量(A)及DNA含量(B)Fig.2 Total Pd in extracted DNA(A)，and total extracted DNA(B)

從圖2A可看出隨著給藥濃度的增加，DNA化合的鈀含量也逐步升高，升高的趨勢與細胞內(nèi)鈀升高趨勢一致，說明DNA化合的鈀含量與細胞內(nèi)鈀含量正相關(guān)，細胞的劑量依賴效應(yīng)明顯。但是當(dāng)給藥濃度超過大部分細胞耐受時細胞大量死亡，收集到的細胞數(shù)量急劇減少，因此測得的細胞內(nèi)鈀含量和DNA化合鈀含量均急劇減少。圖2B中DNA含量的測定提供了細胞群體活動狀態(tài)，如果DNA含量一致那么可認為細胞計數(shù)接近一致，在中低濃度時收集細胞的DNA含量變化不大，說明細胞的生理功能正?；蛘呤軗p程度不至于使大量細胞凋亡，但是高濃度時DNA含量急劇下降，這是因為此時能收集到的活細胞很少，大量的細胞已經(jīng)變性死亡。

2.3 方法學(xué)確證

相對而言,細胞內(nèi)鈀的絕對量大于DNA化合鈀的絕對量，因此配置細胞內(nèi)鈀測定的標準曲線濃度較高，為1.00～10.00 ng/mL，而測定DNA化合鈀的標準曲線濃度較低為0.01～0.50 ng/mL。平行培養(yǎng)6份加藥濃度為60 mg/L的細胞在獲取細胞內(nèi)鈀時加標5.00 ng/mL，在獲取DNA化合鈀時加標0.25 ng/mL，用來計算本方法的精密度和回收率。方法學(xué)數(shù)據(jù)如表2所示。

表2 方法學(xué)確證Table 2 Method validation

從表2可見，由于ICP-MS對重質(zhì)量數(shù)的元素具有高靈敏度和低干擾的優(yōu)勢，因此可以勝任測定痕量的細胞內(nèi)鈀和DNA化合鈀，無論是精密度和回收率都可以滿足實驗要求。

2.4 細胞內(nèi)鈀的分布狀態(tài)

綜合圖1A、圖2中的數(shù)據(jù)計算可得出存活細胞中DNA化合鈀占細胞內(nèi)鈀的比例，還可得出DNA化合鈀與DNA的比值，如表3所示。

表3 DNA化合鈀/細胞內(nèi)鈀和DNA化合鈀/DNATable 3 DNA interacted Pd/cytosolic Pd and DNA interacted Pd/DNA

從表3可看出，1.4%～3.2%細胞內(nèi)鈀被細胞核中DNA捕獲化合，結(jié)合率高于順鉑[16]。這種分布特征表明，細胞內(nèi)絕大多數(shù)鈀存在于細胞質(zhì)中與生物分子結(jié)合，部分生物分子中富含巰基(-SH)可與鈀結(jié)合后排出細胞外，從而減少藥物的細胞毒性，可很大程度避免DNA受到損傷[17-18]。DNA化合鈀與DNA的比值上升表明隨著劑量的增加DNA受損越來越嚴重，細胞核中DNA最高可耐受0.037 ng/μg鈀，超過后DNA無法修復(fù)，從而引起細胞凋亡。

3 討論

本研究可得出乙二胺二氯合鈀對人橫紋肌瘤細胞的毒性具有很強的劑量依賴性，給藥后僅有0.02%～0.05%鈀進入細胞內(nèi)發(fā)揮毒理作用，說明該藥物穿膜效率差，若以后能設(shè)計出穿膜效率高的藥物則可大大降低給藥劑量。進入細胞的藥物大部分與細胞內(nèi)生物分子結(jié)合，僅1.4%～3.2%的鈀與DNA化合，這種細胞內(nèi)鈀分布特點表明乙二胺二氯合鈀被細胞質(zhì)中活性物質(zhì)大量中和。與鉑(Ⅱ)化合物類似，鈀(Ⅱ)化合物主要是通過與DNA化合引起細胞死亡，因此在設(shè)計基于鈀(Ⅱ)類抗癌藥物時最終要考慮細胞內(nèi)DNA與藥物的化合情況。本實驗表明，可通過兩種潛在方式增加鈀(Ⅱ)藥物的效果，一是降低藥物進入細胞的難度和增加排出細胞的難度，使鈀(Ⅱ)在細胞內(nèi)富集效率增加；二是增加細胞內(nèi)鈀(Ⅱ)與DNA結(jié)合率，設(shè)計的鈀(Ⅱ)化合物具有較低的空間位阻，更易與DNA結(jié)合。