脂多糖通過(guò)TLR4-MyD88信號(hào)通路誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型的建立*

王俊力，邵 衛(wèi)，楊 運(yùn)，羅衛(wèi)東，張忠文，梅俊華，陳國(guó)華

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞，它在防御感染和損傷大腦的神經(jīng)炎癥免疫反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用[1]，然而異常激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可導(dǎo)致多種促炎介質(zhì)和細(xì)胞因子的過(guò)度表達(dá)，從而引起神經(jīng)變性相關(guān)疾病(包括帕金森病、阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化、亨廷頓病和缺血性腦卒中)[2-4]。因此，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活可能對(duì)多種神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)后具有重要意義。本研究通過(guò)觀察脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子及相關(guān)信號(hào)通路分子表達(dá)的影響，探討不同活化程度的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞與炎性介質(zhì)之間的關(guān)系及其可能的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，以期建立高效穩(wěn)定的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞和主要試劑

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞株購(gòu)于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；高糖DMEM培養(yǎng)液、青霉素和鏈霉素、0.25%胰酶(含EDTA)購(gòu)于Hyclcone公司；胎牛血清(FBS)購(gòu)于Gibco公司；脂多糖(LPS)購(gòu)于Sigma公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8試劑盒)購(gòu)于DOJINDO公司；NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)ELISA試劑盒購(gòu)于深圳欣博盛生物科技有限公司；Prime ScriptTMRT Master Mix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBRTMPremix Ex Taq TMⅡ(Perfect Real Time)購(gòu)于TaKaRa公司；兔來(lái)源髓樣分化因子88(MyD88)多克隆抗體購(gòu)于Affinity公司；兔來(lái)源Toll樣受體4(TLR4)單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；小鼠來(lái)源β-actin單克隆抗體購(gòu)于Sigma公司；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗購(gòu)于EARTH公司。

1.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)液(含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)培養(yǎng)，放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔3天傳代。

1.3 CCK-8法繪制BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

將BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔5×107/L接種到96孔板中，每孔100 μL，每板4孔，共計(jì)7板；細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)6 d，第2、4、6天按照常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)換液，每次換液后培養(yǎng)液為100 μL；分別于接種后第0、1、2、3、4、5、6天取1板細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，向每孔中加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度(A)值，最終以測(cè)定時(shí)間為橫軸，每次吸光度值的平均值為縱軸，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.4 CCK-8法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×107/L接種到96孔板中，每孔100 μL。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去上清液，PBS清洗3次，向每孔中加入100 μL無(wú)血清高糖DMEM和CCK-8溶液10 μL，37℃孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值；實(shí)驗(yàn)中分別設(shè)立空白組和對(duì)照組，每組設(shè)立4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

1.5 Griess法測(cè)定NO水平

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔1×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到24孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，每組各取50 μL加到96孔板中，再分別加入50 μL Griess試劑Ⅰ和Ⅱ，振蕩混勻后避光反應(yīng)10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的A值。各組中NO含量依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定。

1.6 qRT-PCR檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88 mRNA的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS清洗3次。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA，經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成(反應(yīng)體積20 μL)cDNA。然后以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)方案為：95℃，1 min，預(yù)變性；95℃15 s，58℃20 s，72℃20 s，循環(huán)40次；72℃，末段延伸5 min；熔解曲線：72℃～95℃，每20 s升溫1℃，所用引物序列見(jiàn)表1，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，使用GAPDH作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的表達(dá)量，結(jié)果以TLR4、MyD88與GAPDH mRNA表達(dá)量的比值表示。

表1 qRT-PCR檢測(cè)所用的引物序列及長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences of qRT-PCR detection

1.7 Western blot檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞消化，細(xì)胞計(jì)數(shù)后以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞的密度接種到6孔板中培養(yǎng)。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后，分別加入不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)，24 h后棄去培養(yǎng)液，無(wú)菌PBS清洗3次。加入蛋白酶抑制劑與RIPA裂解緩沖液的混合液提取各組細(xì)胞總蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，計(jì)算出含40 μg蛋白的溶液體積即為上樣量。以β-actin為內(nèi)參，加入5×蛋白上樣緩沖液，100℃水浴5 min。取各組蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后加入5%脫脂奶粉(0.5%TBST配制)常溫?fù)u床封閉1 h。分別加入小鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗TLR4抗體、兔抗MyD88抗體后4℃過(guò)夜。TBST洗膜3次(10 min/次)后分別加入HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗(1∶5000)、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗(1∶5000)室溫下孵育30 min，TBST再次洗膜后加入等體積混勻的ECL化學(xué)發(fā)光試劑A和B，均勻滴加到膜的蛋白面，保持1～2 min后放入凝膠成像儀中曝光成像，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行各組樣本條帶灰度值分析，結(jié)果以TLR4、MyD88蛋白與β-actin條帶灰度值的比值表示。

1.8 ELISA法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α、IL-1β含量

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞以每孔5×107/L接種到96孔板中培養(yǎng)，每孔100 μL。待BV2小膠質(zhì)細(xì)胞貼壁后加入LPS(1 μg/mL)，24 h后收集BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液。用ELISA試劑盒檢測(cè)TNF-α和IL-1β水平，具體操作步驟按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的A值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算TNF-α和IL-1β的含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

根據(jù)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線可知，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞傳代培養(yǎng)后第0～2天是生長(zhǎng)緩慢的潛伏期，第2～3天是對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第3～5天是平頂期，生長(zhǎng)曲線呈平臺(tái)狀，第5天后細(xì)胞開(kāi)始衰亡(圖1)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期BV2小膠質(zhì)細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

圖1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of BV2 microglia

2.2 LPS對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)的影響

圖2為靜息狀態(tài)下的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體小，并具有伸向各個(gè)方向的細(xì)長(zhǎng)突起；圖3為經(jīng)LPS(1 μg/mL)刺激后的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，胞體增生肥大，突起減少且回縮變短，呈圓形或桿狀，形態(tài)呈現(xiàn)類阿米巴樣。

圖2 靜息狀態(tài)BV2細(xì)胞形態(tài)(×100)Fig.2 Morphology of resting BV2 microglia(×100)

2.3 LPS對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響

以對(duì)照組A值為標(biāo)準(zhǔn)(100%)，其余各組A值與對(duì)照組比值代表各組細(xì)胞存活率，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后能明顯降低細(xì)胞存活率，且在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性；不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后細(xì)胞存活率分別為(0.944±0.023)、(0.860±0.023)、(0.761±0.026)、(0.636±0.015)、(0.537±0.017)，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.4 LPS對(duì)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放的影響

LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后能顯著提高NO的釋放量，且在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，LPS濃度為0.25、0.5、1、2、4 μg/mL時(shí)，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞NO釋放量分別為(7.947±0.089)、(10.835±0.292)、(13.132±0.590)、(16.790±0.631)、(23.100±0.751)μmoL，與對(duì)照組(4.142±0.140)μmoL比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5 qRT-PCR檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)

由圖4可知，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后TLR4和MyD88 mRNA的表達(dá)較相應(yīng)對(duì)照組明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；且TLR4 mRNA和MyD88 mRNA的表達(dá)隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均在LPS 1 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖4 qRT-PCR檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88 mRNA表達(dá)Fig.4 Detection of TLR4 and MyD88 mRNA expression in BV2 microglia by qRT-PCR

2.6 Western blot檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)

從圖5可見(jiàn)，LPS刺激BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后TLR4和MyD88蛋白的表達(dá)較相應(yīng)對(duì)照組明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；且TLR4蛋白和MyD88蛋白的表達(dá)隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均在LPS 1 μg/mL達(dá)到峰值。

2.7 ELISA法檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α和IL-1β濃度的變化

LPS(1 μg/mL)作用后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TNF-α的濃度明顯增高[(1115.547±42.269)vs.(128.198±11.077)]，IL-1β的濃度也明顯增高[(98.390±8.831)vs.(16.040±0.285)]，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

與對(duì)照組比較，*P<0.05圖5 Western blot檢測(cè)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4和MyD88蛋白表達(dá)Fig.5 Detection of TLR4 and MyD88 protein expression in BV2 microglia by Western blotting

3 討論

大量研究表明，神經(jīng)炎癥反應(yīng)可引起神經(jīng)元內(nèi)穩(wěn)態(tài)異常及氧化損傷，從而在阿爾茨海默病、多發(fā)性硬化和帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[5-6]。多項(xiàng)前瞻性研究顯示，健康受試者長(zhǎng)期服用非甾體類抗炎藥物可降低阿爾茨海默病和帕金森病的患病率，這間接地表明神經(jīng)炎癥反應(yīng)在神經(jīng)變性性疾病發(fā)病過(guò)程中起重要作用[7-11]。因此，抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)必將為阿爾茨海默病、帕金森病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供新的思路和方案。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的免疫效應(yīng)細(xì)胞，它被激活后主要分化為發(fā)揮促炎作用的M1型和起抗炎作用的M2型[12-14]。在阿爾茨海默病發(fā)病過(guò)程中，小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)清除細(xì)胞外和早期彌漫斑塊內(nèi)的Aβ可以有效促進(jìn)Aβ的產(chǎn)生與清除之間的平衡，有利于腦內(nèi)損傷的修復(fù)；然而，隨著不溶性Aβ在斑塊內(nèi)聚集的形成，小膠質(zhì)細(xì)胞被異常激活，并通過(guò)自分泌或旁分泌方式產(chǎn)生多種促炎介質(zhì)，如腫瘤壞死因子、白介素-1β、白介素-6、一氧化氮和活性氧(ROS)等，這些介質(zhì)對(duì)神經(jīng)元產(chǎn)生強(qiáng)烈的毒性作用，導(dǎo)致腦內(nèi)損傷的進(jìn)一步惡化[15-17]。因此，調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少炎癥介質(zhì)的表達(dá)，從而減輕神經(jīng)炎癥損傷是阿爾茨海默病研究的主要靶向之一。

BV2小膠質(zhì)細(xì)胞是小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染v-raf/v-myc后獲得永生化的細(xì)胞系。該細(xì)胞系高度純化，且保留有小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、表型及各種功能，是研究小膠質(zhì)細(xì)胞理想的體外模型。脂多糖(LPS)為革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的特征成分，它與小膠質(zhì)細(xì)胞膜上的TLR4受體結(jié)合啟動(dòng)TLR4信號(hào)通路的傳導(dǎo)。TLR4通過(guò)其銜接蛋白MyD88和TRIF途徑下傳信號(hào)，其中MyD88途徑是經(jīng)典信號(hào)傳導(dǎo)途徑，其誘導(dǎo)的信號(hào)主要產(chǎn)生促炎介質(zhì)[18-20]。因此，建立高效穩(wěn)定的BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型和探討B(tài)V2小膠質(zhì)細(xì)胞激活的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制對(duì)阿爾茨海默病的體外研究尤為重要。

本實(shí)驗(yàn)分別用不同濃度的LPS(0.25、0.5、1、2、4 μg/mL)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞被LPS激活后，BV2小膠質(zhì)細(xì)胞胞體增生肥大，突起減少回縮變短，呈圓形或桿狀，形態(tài)呈現(xiàn)類阿米巴樣；LPS能明顯降低BV2小膠質(zhì)細(xì)胞存活率及提高NO釋放量，且在實(shí)驗(yàn)劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系；TLR4、MyD88 mRNA及蛋白的表達(dá)隨著LPS濃度增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，且均在LPS 1 μg/mL時(shí)達(dá)到峰值；LPS(1 μg/mL)誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞后顯著提高TNF-α和IL-1β濃度。

綜上所述，LPS可能通過(guò)TLR4信號(hào)通路誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞活化，進(jìn)而上調(diào)其炎性介質(zhì)的水平。同時(shí)結(jié)合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：1 μg/mL LPS是建立高效穩(wěn)定BV2小膠質(zhì)細(xì)胞激活模型的最佳濃度。TLR4信號(hào)通路可能是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞激活、減少炎癥損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。尋找和開(kāi)發(fā)靶向調(diào)控TLR4信號(hào)通路的藥物可能對(duì)阿爾茨海默病等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)炎癥反應(yīng)的控制及預(yù)后改善具有重要意義。當(dāng)然，靶向調(diào)控TLR4信號(hào)通路的藥物還需在今后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究中進(jìn)一步驗(yàn)證。