長鏈非編碼RNA SNHG16在胰腺癌中的表達(dá)及功能*

王 劍，馬松林，周婷婷，廖宇圣

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院消化內(nèi)科，武漢 430014

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是致死率極高的惡性腫瘤，在全球癌癥致死率中排名第4[1]。近年來，盡管手術(shù)、放療和化療等治療方法取得了長足的進(jìn)步，胰腺癌的5年總生存率仍不盡人意，主要原因是其易轉(zhuǎn)移和化療耐藥性[2]，因此需要對與胰腺癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究。

長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后翻譯和表觀遺傳基因調(diào)控上發(fā)揮廣泛的作用[3]。lncRNAs在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中參與腫瘤相關(guān)基因或miRNA的調(diào)節(jié)而發(fā)揮抑癌或致癌作用，是潛在的診斷和治療的分子標(biāo)志物[4-5]。lncRNA小核仁RNA宿主基因16(SNHG16)在多種惡性腫瘤中表達(dá)異常[6-7]，但其在胰腺癌中的表達(dá)情況和功能尚不清楚。本研究旨在探討PC患者SNHG16表達(dá)情況、臨床意義及其功能和作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 組織樣本收集

收集2014年1月到2018年1月間在武漢市中心醫(yī)院普通外科診斷和手術(shù)治療的胰腺癌患者共46例的臨床病理標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者經(jīng)病理診斷為胰腺癌且不存在其他部位腫瘤；②患者具有完整的臨床資料和隨訪信息；③患者手術(shù)前未接受任何其他治療(包括放化療和生物治療)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受化療者；②臨床資料和隨訪資料不全或病理組織不合格者?；颊呤中g(shù)后立即將胰腺癌組織和癌旁組織在液氮中直接冷凍并儲存在-80℃冰箱。本研究根據(jù)赫爾辛基宣言的原則，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 臨床資料和隨訪

從患者臨床病歷資料中收集患者年齡、性別、病理類型和TNM分期等信息，術(shù)后隨訪采用定期門診復(fù)診和電話隨訪方式進(jìn)行，每半年隨訪1次，共失訪2人。術(shù)后總生存時(shí)間為手術(shù)治療日起至死亡時(shí)間間隔，中位隨訪時(shí)間為24個(gè)月。

1.3 主要試劑和儀器

4種人胰腺癌細(xì)胞系(BxPC-3、SW1990、PANC-1和AsPC-1)及胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系(HPDE6-C7)購自美國ATCC。One Step Prime script miRNA cDNA合成試劑盒、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)、微孔板分光光度計(jì)、RIPA緩沖液、抗體[抗β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、抗c-myc和抗細(xì)胞周期蛋白D1(cyclin D1)]購于北京生物試劑有限公司?；|(zhì)膠Matrigel及Transwell小室購自美國BD公司，ThermoND2000C超微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司，GeneAmp PCR system 9700擴(kuò)增儀購自美國PerkinElmer公司，靶向干擾RNA序列(si-SNHG16)和陰性對照序列(si-NC)均由上海吉瑪公司化學(xué)合成。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 將4種胰腺癌細(xì)胞系和正常胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系置于含有10%胎牛血清和雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)液，并在37℃和5%CO2下培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)所需的細(xì)胞均為對數(shù)生長期細(xì)胞。按LipofectamineTM2000說明書方案靶向干擾RNA(si-SNHG16)和陰性對照(si-NC)轉(zhuǎn)染AsPC-1細(xì)胞，并分成SNHG16敲低組(si-SNHG16組)和陰性對照組(si-NC組)，通過qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.4.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 將適量組織加入1 mL RNAiso plus研磨，隨后加入200 μL氯仿，振蕩并靜置10 min，在12000 r/min及44 ℃條件下離心15 min，隨后加入異丙醇，離心后收集沉淀，用1 mL 75%乙醇洗滌后晾干，總RNA的濃度在分光光度計(jì)下測定。采用SureCycler 8800 PCR儀(Agilent Technologie)行逆轉(zhuǎn)錄，加入RR036A逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，合成cDNA。PCR引物由上海吉瑪生物公司合成。SNHG16上游引物：5′-ACATCGGCATGATGGCAGAA-3′；下游引物：5′-TCACAAAAGGCGGGACCAC-3′。GAPDH上游引物：5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3′；下游引物：5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3′。以GAPDH為內(nèi)參對照，結(jié)果分析采用2-ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)的相對定量。根據(jù)癌組織中SNHG16的表達(dá)中位值將46名患者分為SNHG16高表達(dá)組(n=25例)和低表達(dá)組(n=21例)

1.4.3 細(xì)胞增殖和凋亡實(shí)驗(yàn) 用CCK-8試劑盒測定體外細(xì)胞增殖。在96孔板中接種轉(zhuǎn)染的AsPC-1細(xì)胞(5×103個(gè)/孔)培養(yǎng)96 h，每隔24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育4 h。然后用微孔板分光光度計(jì)在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)測量490 nm處的吸光度。使用Annexin Ⅴ-熒光素異硫氰酸酯(FITC)/碘化丙啶(PI)檢測試劑盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)以流式細(xì)胞術(shù)評估凋亡程度。將總共約5×104個(gè)AsPC-1細(xì)胞接種到6孔板中用于細(xì)胞凋亡測定，使用Annexin Ⅴ-FITC凋亡檢測試劑盒進(jìn)行測試，使用Cell-Quest軟件分析細(xì)胞凋亡率。

1.4.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 用Transwell實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞侵襲能力，待AsPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，經(jīng)胰酶消化離心后，將1×105個(gè)/100 μL細(xì)胞懸液接種于Matrigel包被的Transwell小室的上室，下室加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液500 μL，48 h后取出小室，采用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，結(jié)晶紫染色10 min，在200倍視野下計(jì)數(shù)3個(gè)視野穿出小室的細(xì)胞數(shù)。

1.4.5 熒光素酶檢測 TOP/FOP閃光熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)參照文獻(xiàn)[8]的方法檢測細(xì)胞Wnt/β-catenin信號激活狀態(tài)。將轉(zhuǎn)染后的AsPC-1細(xì)胞在16孔板(2×104個(gè)/孔)中培養(yǎng)，48 h后收獲細(xì)胞并裂解用于熒光素酶測定，以海腎TK熒光素酶載體作為內(nèi)部對照。

1.4.6 蛋白印跡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞在RIPA緩沖液中裂解，并使用蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。通過十二烷基硫酸鹽，鈉鹽-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白質(zhì)樣品，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。用含有0.05%Tween 20的Tris緩沖鹽水洗膜，再以5%脫脂乳封閉，并與第一抗體一起在4℃下以1∶200的濃度孵育至少12 h，然后與辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)的第二抗體在室溫下孵育2 h。根據(jù)制造商的方案，通過酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行條帶檢測。GAPDH蛋白條帶用作對照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 SNHG16在胰腺癌患者癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)

胰腺癌組織中SNHG16的相對表達(dá)量顯著高于癌旁組織(P<0.01)，見圖1A；在4個(gè)胰腺癌細(xì)胞系(BxPC-3、SW1990、PANC-1和AsPC-1)中SNHG16的表達(dá)水平顯著高于人胰腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞系HPDE6-C7(均P<0.01)，見圖1B。

A：胰腺癌與癌旁組織；B：胰腺癌細(xì)胞系；與癌旁組織和HPDE6-C7比較,**P<0.01圖1 SNHG16在人胰腺癌組織和胰腺癌細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)Fig.1 Up-regulation of SNHG16 expression in human pancreatic cancer tissue and pancreatic cancer cell line

2.2 胰腺癌組織中SNHG16表達(dá)的臨床意義

SNHG16高表達(dá)與腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(均P<0.05)，而與年齡、性別無相關(guān)性(均P> 0.05)，見表1。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，SNHG16高表達(dá)組患者總生存率顯著低于SNHG16低表達(dá)組患者(P=0.003)，見圖2。

圖2 SNHG16高表達(dá)組和低表達(dá)組胰腺癌患者總生存率比較Fig.2 Comparison of overall survival of patients with pancreatic cancer between SNHG16 high expression group and SNHG16 low expression group

表1 SNHG16表達(dá)與胰腺癌患者的臨床病理因素的關(guān)系Table 1 Association of SNHG16 expression with clinicopathologic factors of patients with pancreatic cancer

2.3 SNHG16敲低抑制胰腺癌細(xì)胞增殖

si-SNHG16組SNHG16的相對表達(dá)量較si-NC組顯著降低(P<0.01)，見圖3A；CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示敲低SNHG16表達(dá)48、72及96 h后，si-SNHG16組A490nm值顯著低于si-NC組(均P<0.01)，見圖3B。

2.4 SNHG16敲低促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡

凋亡實(shí)驗(yàn)顯示敲低SNHG16表達(dá)后，si-SNHG16組細(xì)胞凋亡率顯著高于si-NC組，(15.3±1.5)%vs.(4.8±0.4)%，P<0.01，見圖4。

A：敲低效率測定；B：CCK-8實(shí)驗(yàn)；與si-NC組比較，**P<0.01圖3 SNHG16敲低抑制胰腺癌細(xì)胞增殖Fig.3 Knockdown of SNHG16 inhibited the proliferation of pancreatic cancer cells

A：流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡；B：凋亡率的比較,與si-NC組比較,**P<0.01圖4 敲低SNHG16表達(dá)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞凋亡Fig.4 Knockdown of SNHG16 promoted apoptosis of pancreatic cancer cells

2.5 SNHG16敲低抑制胰腺癌細(xì)胞侵襲

Transwell實(shí)驗(yàn)顯示，200倍視野下，SNHG16敲低導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.01)，si-SNHG16組侵襲細(xì)胞數(shù)(202±13)顯著少于si-NC組(411±15)，見圖5。

2.6 敲低SNHG16表達(dá)抑制胰腺癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路激活

Wnt途徑激活TOP/FOP熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)AsPC-1細(xì)胞中SNHG16表達(dá)下調(diào)時(shí)，Wnt/β-catenin信號通路的活性受到抑制(圖6A)；蛋白印跡檢測Wnt/β-catenin活性相關(guān)蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，敲低SNHG16表達(dá)水平后，胰腺癌細(xì)胞系(AsPC-1)細(xì)胞中c-myc、β-catenin和cyclin D1表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)(圖6B)。

A：TOP熒光素酶閃光矢量檢測轉(zhuǎn)染后AsPC-1中β-catenin/淋巴增強(qiáng)結(jié)合因子啟動(dòng)子活性；B：蛋白印跡分析顯示轉(zhuǎn)染后AsPC-1細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑組分的變化,與si-NC組比較,**P<0.01圖6 SNHG16敲低抑制AsPC-1中Wnt/β-catenin途徑激活Fig.6 Knockdown of SNHG16 suppressed activation of Wnt/β-catenin signaling pathway in AsPC-1

3 討論

胰腺癌是常見的高致死性癌癥，即使在美國胰腺癌患者5年生存率仍低至6%[9]。胰腺癌診斷時(shí)往往處于晚期，即使符合手術(shù)切除標(biāo)準(zhǔn)的胰腺癌患者術(shù)后5年生存率仍低于20%[9]。積極研究胰腺癌發(fā)病分子基礎(chǔ)和預(yù)后標(biāo)志物對改善胰腺癌患者預(yù)后尤為重要。

lncRNAs是一類大于200個(gè)核苷酸且沒有蛋白質(zhì)編碼能力的RNA分子[10]，隨著大量lncRNAs的發(fā)現(xiàn)和功能鑒定，部分被認(rèn)為是胰腺癌診斷和預(yù)后的分子標(biāo)志物[11-12]。文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA TUG1可通過靶向miR-29c在體外和體內(nèi)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞生長及遷移[13]。文獻(xiàn)報(bào)道SNHG1上調(diào)通過抑制胰腺癌中Notch-1信號通路抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲[14]。lncRNA GAS5通過調(diào)節(jié)miR-221/SOCS3途徑介導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞自我更新和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和對吉西他濱的耐藥性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中SNHG16表達(dá)顯著高于癌旁組織，同時(shí)發(fā)現(xiàn)4種胰腺癌細(xì)胞系中SNHG16表達(dá)顯著高于HPDE6-C7細(xì)胞系。胰腺癌患者癌組織中SNHG16的高表達(dá)與患者腫瘤分化程度、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(均P<0.05)，且SNHG16高表達(dá)患者總生存率顯著降低，提示SNHG16表達(dá)增加與預(yù)后不良和總生存率降低相關(guān)，是潛在的預(yù)測胰腺癌不良預(yù)后的分子標(biāo)志物。文獻(xiàn)報(bào)道SNHG16在幾種惡性腫瘤如口腔癌[16]和非小細(xì)胞肺癌[17]中發(fā)揮致癌基因作用，且可作為上述癌癥預(yù)后不良的分子標(biāo)志物，本研究結(jié)果與上述結(jié)果存在一致性。本研究發(fā)現(xiàn)SNHG16表達(dá)下調(diào)可致癌細(xì)胞增殖和侵襲能力受到抑制，且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示其可能在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮促進(jìn)作用。

Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑與腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展密切相關(guān)，其在細(xì)胞生長、發(fā)育和干細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[18]。本研究發(fā)現(xiàn)敲低SNHG16表達(dá)可顯著性抑制Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑的活性，且Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)蛋白表達(dá)水平明顯降低。文獻(xiàn)報(bào)道lncRNA UCA1可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和遷移[19]，lncRNA CASC11通過激活Wnt/β-catenin途徑促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長和轉(zhuǎn)移[20]，提示SNHG16可能通過參與Wnt/β-catenin信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)胰腺癌增殖和侵襲過程。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)lncRNA SNHG16在胰腺癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總生存率相關(guān)，是胰腺癌潛在的分子標(biāo)志物。SNHG16敲低可抑制胰腺癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路活性而發(fā)揮抗癌作用。