復(fù)氧前給予不同濃度乳化異氟醚的大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷情況觀察

王佳琪,徐鵬,陳偉,李曉娟,王海英,喻田

1 遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院，貴州遵義563000；2 湘潭市中心醫(yī)院

隨著缺血性心肌病發(fā)病率逐年提高，手術(shù)治療缺血性心肌病也日漸普遍，但此過程不可避免的發(fā)生心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。如何降低MIRI成為減輕心臟疾病術(shù)后并發(fā)癥的重要策略。乳化異氟醚(EI)由液態(tài)異氟醚溶于30%脂肪乳(FAT)配制而成，兼有靜脈麻醉藥和揮發(fā)性麻醉藥的優(yōu)點。研究[1]顯示，應(yīng)用EI后處理可以減輕MIRI，推測EI發(fā)揮了抵抗氧化應(yīng)激的功能[2]。NF-E2相關(guān)因子2/抗氧化反應(yīng)原件通路(Nrf2-ARE通路)在抗氧化應(yīng)激、降低MIRI過程中扮演著重要的角色[3]。本課題組前期使用EI處理離體鼠缺血再灌注心肌，證實了EI可通過激活Nrf2-ARE通路而達(dá)到減輕MIRI的目的。2013年9月～2017年6月，我們觀察了不同濃度EI處理對大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護作用，并探討其保護作用的機制。

1 材料與方法

1.1 心肌細(xì)胞分離及培養(yǎng) 雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300g，16～20周齡，由陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院動物中心提供，證書號：SCXK(渝)2012-0005。大鼠腹腔注射異戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、肝素(250 μg/kg)，待麻醉起效后開胸剪下心臟，立即放入0 ℃、750 μmol/L Ca2+液中擠壓排盡心腔中的血液。將心臟主動脈根部固定于Langendorff離體心臟灌注裝置上，先后灌注經(jīng)氧合的750 μmol/L Ca2+液2 min、100 μmol/L 無Ca2+EGTA液4 min、0.1% Ⅱ型膠原酶15 min(流量設(shè)置為9 mL/min·g)，隨后用無菌剪刀剪下心室，縱向?qū)⑿氖壹〖糸_放入盛有含1% BSA的Ⅱ型膠原酶液搖瓶，在37 ℃恒溫水浴搖床中手動順時針搖動搖瓶5 min，通過200目尼龍濾網(wǎng)收集到無菌管中待細(xì)胞沉淀，以上步驟重復(fù)4次?；旌纤屑?xì)胞并棄上清，加入酶洗脫液、M199培養(yǎng)基洗滌2次后，用臺盼蘭染色判定細(xì)胞存活率，大于90%則將細(xì)胞混合M199培養(yǎng)基以1×104～1×106個/cm2的密度平鋪于預(yù)先用層黏連蛋白處理的六孔板中，4 h后吸走未貼壁細(xì)胞并重新加入新鮮M199培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.2 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型的制備及驗證 采用混合氣體培養(yǎng)法制備缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型。將心肌細(xì)胞分為正常組(N組)、缺氧/復(fù)氧模型組(HR組)、脂肪乳組(FAT組)。N組在37 ℃、95% O2+5%CO2培養(yǎng)箱中持續(xù)培養(yǎng)105 min；HR組在37 ℃、95% N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)45 min，然后在37 ℃、95% O2+5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)60 min；FAT組在37 ℃、95% N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)45 min，加入脂肪乳處理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)55 min。收集三組心肌細(xì)胞，1 200～2 000 r/min低速離心10 min使細(xì)胞成團，加入4 ℃、2.5%戊二醛固定液固定后，經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋聚合、超薄切片，在H7500透射電鏡下觀察兩組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。觀察發(fā)現(xiàn)，HR組、FAT組心肌細(xì)胞線粒體排列紊亂，線粒體空泡化及囊泡化，外膜連續(xù)性喪失，少部分線粒體甚至破裂、溶解，心肌肌原纖維雜亂排列，肌漿網(wǎng)擴張，細(xì)胞核形態(tài)不一，核膜溶解消失；N組心肌細(xì)胞細(xì)胞器基本正常；表明缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型建立成功，且脂肪乳的加入對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞模型的建立無影響。

1.3 心肌細(xì)胞分組及EI給予方法 隨機將心肌細(xì)胞分為FAT組和不同濃度EI處理組(EI1組、EI2組、EI3組)。FAT組在37℃、95%N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)45 min，加入FAT處理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)55 min；不同濃度EI處理組(EI1組、EI2組、EI3組)在37 ℃、95%N2+5%CO2培養(yǎng)箱中缺氧培養(yǎng)45 min，分別加入三種濃度EI(EI1組：0.84 mmol/L，EI2組：1.68 mmol/L，EI3組：2.52 mmol/L)處理5 min，然后在37 ℃、95%O2+5%CO2培養(yǎng)箱中復(fù)氧培養(yǎng)55 min。

1.4 各組細(xì)胞線粒體損傷評分(Flameng評分)及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度測定 ①收集各組心肌細(xì)胞，1 200～2 000 r/min低速離心10 min使細(xì)胞成團，加入4 ℃ 2.5%戊二醛固定液固定后，經(jīng)乙醇梯度脫水、包埋聚合、超薄切片，在H7500透射電鏡下觀察，每個標(biāo)本隨機選擇5個視野，每個視野內(nèi)隨機選擇20個線粒體，通過線粒體Flameng評分標(biāo)準(zhǔn)對所選擇的線粒體進行評分。0分：線粒體結(jié)構(gòu)正常,充滿顆粒；1分：線粒體結(jié)構(gòu)基本正常，基質(zhì)顆粒丟失；2分：線粒體腫脹,基質(zhì)透明；3分：線粒體嵴斷裂,伴基質(zhì)透明和濃聚；4分：線粒體嵴分裂，線粒體內(nèi)外膜完整性消失，呈空泡狀。最后將100個線粒體所得的總分取平均值，即為該標(biāo)本的Flameng評分。Flameng評分越高表示細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。②收集各組心肌細(xì)胞，加入10 μmol/L Ca2+探針Fluo-3，放于37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，通過Sp2軟件分析心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度。心肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度越高表示細(xì)胞損傷越嚴(yán)重。

1.5 各組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度觀察 收集各組心肌細(xì)胞，經(jīng)0.5%TritonX-100處理，在1%BSA的PBS溶液中孵育、封閉、結(jié)合Nrf2單克隆抗體一抗(稀釋度1∶1 000)、結(jié)合熒光標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體(稀釋度1∶1 000)，用DAPI染料標(biāo)記細(xì)胞核5 min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察，通過Image Pro Plus系統(tǒng)分析細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度。

1.6 各組細(xì)胞中Nrf2、血紅素加氧酶-1(HO-1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、醌氧化還原酶1(NQO1)mRNA檢測 采用RT-PCR法。收集各組心肌細(xì)胞，TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增。引物序列如下：Nrf2上游引物為5′-TTGGCAGAGACATTCCCATTTGTA-3′，下游引物為5′-ATCAGTCATGGCCGTCTCCAG-3′；HO-1上游引物為5′-AGGTGCACATCCGTGCAGAG-3′，下游引物為5′-TCCAGGGCCGTATAGATATGGTACA-3′；SOD1上游引物為5′-AATGTGTCCATTGAAGATCGTGTGA-3′，下游引物為5′-GCTTCCAGCATTTCCAGTCTTTGTA-3′；NQO1上游引物為5′-TGGAAGCTGCAGACCTGGTG-3′，下游引物為5′-TTGTCATACATGGTGGCATACGTG-3′；GAPDH上游引物為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物為5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s、61.4 ℃退火20 s，循環(huán)40次。以2-ΔCt表示細(xì)胞中目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.7 各組細(xì)胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1蛋白檢測 采用Western blotting法。收集各組心肌細(xì)胞，BCA法對蛋白定量，SDS-PAGE電泳儀行蛋白質(zhì)電泳，電泳結(jié)束后按分子量切取凝膠，并進行轉(zhuǎn)膜、封膜，分別封閉一抗(稀釋度1∶500)4 ℃ 過夜，加入熒光二抗(稀釋度1∶10 000)，采用Odyssey紅外熒光成像系統(tǒng)避光封閉1 h，掃描PVDF膜，記錄各條帶的積分光密度值(IOD值)，計算目的蛋白的相對表達(dá)量。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白IOD值/內(nèi)參蛋白IOD值×100%。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞線粒體Flameng評分及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度比較 各組細(xì)胞線粒體Flameng評分及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度比較見表1。由表1可知，不同濃度EI處理組線粒體Flameng評分和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度均低于FAT組，且EI2組最低。

表1 各組細(xì)胞線粒體Flameng評分及細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度比較

注：與EI1組相比，aP<0.05；與EI2組相比，bP<0.05；與EI3組相比，cP<0.05。

2.2 各組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度比較 EI1組、EI2組、EI3組、FAT組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度分別為152.71±13.36、181.95±10.59、156.39±11.20、135.25±19.73；其中，EI2組細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位熒光強度與EI1組、EI3組、FAT組相比，P均<0.05；EI1組、EI3組細(xì)胞內(nèi)Nrf2核轉(zhuǎn)位熒光強度與FAT組相比，P均<0.05。

2.3 各組細(xì)胞中Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較 各組細(xì)胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白比較見表2。由表2可知，不同濃度EI處理組Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均高于FAT組，且EI2組最高。

3 討論

Jenning[4]早在1960年便提出了MIRI。研究[5，6]顯示，藥物后處理是目前減輕MIRI最優(yōu)的方式。EI是我國自主研發(fā)的新型麻醉藥，它與傳統(tǒng)的異氟醚相比具有可控性強、使用方便、不污染環(huán)境且效能高的優(yōu)點，且已經(jīng)證明其可安全用于動物實驗[7]，起到腦保護[8]、腎臟保護[9]及心肌保護作用[10],其對于MIRI保護作用可能與激活Nrf2-ARE通路有關(guān)。本研究觀察了EI對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞保護作用的機制，并探究其最佳保護濃度。

表2 各組細(xì)胞Nrf2、HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與EI1組相比，aP<0.05；與EI2組相比，bP<0.05；與EI3組相比，cP<0.05。

細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變是其損傷最直觀的肉眼表現(xiàn)[11]，與N組相比，HR組心肌細(xì)胞在電鏡下失去正常超微結(jié)構(gòu)，損傷極為嚴(yán)重，且FAT組心肌細(xì)胞損傷與HR組相似，說明本實驗大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型制備成功，且FAT對于缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型無影響。

線粒體是細(xì)胞有氧氧化能量產(chǎn)生的聚集地，對缺血、缺氧十分敏感，其結(jié)構(gòu)的改變往往與細(xì)胞的生存狀態(tài)密切相關(guān)[12]。當(dāng)細(xì)胞缺氧時會發(fā)生代謝紊亂，乳酸和琥珀酸堆積，當(dāng)其再次遇到氧氣時，會產(chǎn)生活性氧，發(fā)生細(xì)胞核內(nèi)Ca2+堆積進而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,故本實驗以線粒體Flameng評分和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度來判斷細(xì)胞損傷狀況。線粒體Flameng評分和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度均顯示，不同濃度EI處理組線粒體Flameng評分和細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+熒光強度均低于FAT組，說明EI對于缺氧/復(fù)氧細(xì)胞有保護作用，其中EI2組最低，說明此時EI的濃度對缺氧/復(fù)氧細(xì)胞的保護作用最佳。

當(dāng)Nrf2蛋白受到親電子物質(zhì)作用時，會發(fā)生磷酸化進入細(xì)胞核識別ARE，啟動下游靶基因如HO-1、SOD1、NQO1的表達(dá)，激發(fā)細(xì)胞對抗氧化應(yīng)激的能力[13]。本實驗細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度顯示，不同濃度EI處理組細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位熒光強度均高于FAT組，且EI2組最高，說明EI可以促進Nrf2蛋白進入細(xì)胞核，且EI2組的濃度對于促進Nrf2蛋白核轉(zhuǎn)位最佳。同時，本研究結(jié)果顯示，Nrf2及Nrf2/ARE通路的下游產(chǎn)物HO-1、SOD1、NQO1 mRNA和蛋白相對表達(dá)量在不同濃度EI處理組表達(dá)較FAT組升高，且EI2組最高，說明EI對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護作用是通過激活Nrf2/ARE通路而實現(xiàn)，且EI2組的濃度(1.68 mmol/L)保護作用最佳。

綜上所述，復(fù)氧前給予不同濃度EI處理對大鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞均可起到保護作用，1.68 mmol/L EI是減輕大鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的最適濃度，EI可能是通過激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮保護作用。