高劑量異丙酚腹腔注射對(duì)阿爾茨海默病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用及其機(jī)制

宋云飛

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，沈陽(yáng)110032

阿爾茨海默病(AD)是好發(fā)于65歲以上老年人的神經(jīng)退行性疾病之一，又名老年癡呆癥。隨著人口的老齡化，AD的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。目前對(duì)AD的發(fā)病機(jī)制較為公認(rèn)的是β-淀粉樣蛋白(Aβ蛋白)腦內(nèi)沉積引起神經(jīng)元丟失及神經(jīng)激素調(diào)節(jié)、氧化損傷和膽堿能不足等病理過(guò)程有關(guān)[1～3]。目前治療AD比較有效的藥物有乙酰膽堿酯酶抑制劑(AchE，如多奈哌齊、石杉?jí)A甲等)[4]、NMDA受體拮抗劑(如美金剛等)[5]，但這些藥物只能改善輕至中度AD患者的癥狀，且不良反應(yīng)較多，因此開(kāi)發(fā)一種治療AD安全有效的藥物尤為重要。異丙酚(PPF)是臨床上用于靜脈全麻常用藥物之一，具有醒腦快、持續(xù)輸注、無(wú)蓄積等優(yōu)點(diǎn)。近年來(lái)研究[6]發(fā)現(xiàn)，PPF對(duì)大腦、腎臟及肝臟等器官具有較好的保護(hù)作用。趙冬梅等[7]發(fā)現(xiàn)，PPF預(yù)處理能改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腦保護(hù)作用。倪天輝等[8]也報(bào)道PPF預(yù)處理能增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元表達(dá)，達(dá)到腦保護(hù)目的。然而，PPF是否通過(guò)抗炎作用來(lái)改善AD大鼠的學(xué)習(xí)與記憶能力尚不清楚。2019年6月3日～2019年12月5日，本研究用腹腔注射D-半乳糖(D-gal)聯(lián)合灌胃三氯化鋁(AlCl3)制備AD模型大鼠，觀察高劑量PPF對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 大鼠、試劑和儀器 SPF級(jí)SD大鼠購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(遼)2010-001。雌雄不限，體質(zhì)量(200±20)g。所有大鼠被安置在一個(gè)符合SPF級(jí)標(biāo)準(zhǔn)的動(dòng)物房間里，溫度18～24 ℃，相對(duì)濕度55%～65%，12小時(shí)亮/暗循環(huán)，每籠4只大鼠，可自由取用食物和水。所有本研究中使用的實(shí)驗(yàn)方案均得到了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。異丙酚(PPF)購(gòu)自Sigma公司，生理鹽水購(gòu)自沈陽(yáng)志鷹制藥廠，D-gal購(gòu)自Reanta Scientific Technology company，AlCl3購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，鹽酸多奈哌齊片購(gòu)自衛(wèi)材藥業(yè)有限公司，IL-1β、IL-6和TNF-α ELISA試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，AchE試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，兔抗Aβ、磷酸化NF-κB(p-NF-κB)和GAPDH抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗兔IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，蛋白提取試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。Morris 水迷宮MT-200購(gòu)自成都泰盟科技公司，超低溫冰箱購(gòu)自青島海爾集團(tuán)，WB電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自Bio-Rad生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 AD模型的制備、分組及PPF給予方法 SD大鼠每日1次腹腔注射D-gal，劑量為60 mg/kg，同時(shí)每日1次灌胃AlCl3，劑量為40 mg/kg，連續(xù)給藥60 d，建立大鼠AD模型[9]。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為4組，即模型組、多奈哌齊組、PPF低劑量組、PPF高劑量組，每組6只。多奈哌齊組腹腔注射1.5 mg/kg的多奈哌齊，PPF低劑量組腹腔注射50 mg/kg的PPF，PPF高劑量組腹腔注射100 mg/kg的PPF，模型組腹腔注射等體積生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥30天。各組大鼠腹腔注射藥物或生理鹽水的同時(shí)，繼續(xù)按照造模要求每日進(jìn)行D-gal腹腔注射和AlCl3灌胃。另選取6只正常SD大鼠，記為空白對(duì)照組。

1.3 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力評(píng)估 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，包括定位航行實(shí)驗(yàn)、空間探索實(shí)驗(yàn)。①定位航行實(shí)驗(yàn)。將大鼠由平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)且頭朝池壁放入水中，記錄大鼠找到且爬上平臺(tái)所需的時(shí)間，即為大鼠的逃避潛伏期;觀察大鼠逃避潛伏期的運(yùn)動(dòng)軌跡，采用MT-200 Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)自動(dòng)采集并導(dǎo)出運(yùn)動(dòng)軌跡圖像。若逃避潛伏期超過(guò)60 s，則引導(dǎo)大鼠爬上平臺(tái)并停留10 s，并將其逃避潛伏期記錄為60 s。定位航行實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行5天，以第5天的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為本研究的最終數(shù)據(jù)。②空間探索實(shí)驗(yàn)。定位航行實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，撤除平臺(tái)，按定位航行實(shí)驗(yàn)方法將大鼠放入水中，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)次數(shù)和在原平臺(tái)所在象限停留時(shí)間。

1.4 各組大鼠海馬組織中Aβ和p-NF-κB蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，斷頭處死大鼠，分離大鼠雙側(cè)海馬組織放入玻璃勻漿器中勻漿，加入蛋白裂解液和終濃度為1 mmol/L的PMSF在冰上裂解30 min，然后將液體轉(zhuǎn)移至EP管中，4 ℃條件下離心，取少量上清液用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量并調(diào)整至等濃度，用等體積的蛋白上樣緩沖液稀釋，SDS-PAGE電泳分離，轉(zhuǎn)移到0.22 μm PVDF膜，用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶500稀釋的Aβ、p-NF-κB和GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜3次后，加入二抗至搖床上室溫孵育1 h，ECL發(fā)光后膠片暗室曝光顯影，用Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白GAPDH的光密度比值表示海馬組織中目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 各組大鼠海馬組織中AchE活力檢測(cè) 采用比色法。取大鼠海馬組織用預(yù)冷的生理鹽水制成10%組織勻漿，按照AchE測(cè)試盒說(shuō)明書要求，檢測(cè)大鼠海馬組織中AchE活力。

1.6 各組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白檢測(cè) 采用ELISA法。取大鼠海馬組織，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書所示步驟檢測(cè)各組大鼠海馬組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較見(jiàn)表1。大鼠逃避潛伏期典型游動(dòng)軌跡見(jiàn)圖1。

表1 各組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力比較

注：與空白對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與多奈哌齊組相比，cP<0.05；與PPF低劑量組相比，dP<0.05。

圖1 大鼠逃避潛伏期典型游動(dòng)軌跡

2.2 各組大鼠海馬組織中Aβ蛋白相對(duì)表達(dá)量、AchE活力比較 各組大鼠海馬組織中Aβ蛋白相對(duì)表達(dá)量、AchE活力比較見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠海馬組織中p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量和IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較 各組大鼠海馬組織中p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量和IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較見(jiàn)表3。

表2 各組大鼠海馬組織中Aβ蛋白相對(duì)表達(dá)量、AchE活力比較

注：與空白對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與多奈哌齊組相比，cP<0.05；與PPF低劑量組相比，dP<0.05。

表3 各組大鼠海馬組織中p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量和IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)水平比較

注：與空白對(duì)照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與多奈哌齊組相比，cP<0.05；與PPF低劑量組相比，dP<0.05。

3 討論

AD是一種病因復(fù)雜且呈進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病，在全球人口老齡化的趨勢(shì)下，AD發(fā)病率逐年上升。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制，學(xué)者們提出了多種假說(shuō)，包括膽堿能假說(shuō)、淀粉樣蛋白假說(shuō)、基因突變假說(shuō)、炎癥免疫假說(shuō)等?；谏鲜黾僬f(shuō)，學(xué)者們建立了開(kāi)展AD研究的多種動(dòng)物模型。研究[10]顯示，D-gal可造成動(dòng)物亞急性衰老，其代謝產(chǎn)物半乳糖醇在細(xì)胞內(nèi)堆積可引起細(xì)胞代謝紊亂，致體內(nèi)活性氧增多，可引起機(jī)體多器官、多系統(tǒng)功能衰退，與人體老齡變化非常相似。此外，D-gal還能引起腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)目減少、腦組織中炎癥因子釋放增多等變化，而這些變化與AD患者腦內(nèi)的病理變化十分類似。不同研究者使用的D-gal劑量為60～180 mg/kg，給藥時(shí)間從6周到3個(gè)月不等。本研究中采用的是60 mg/kg、連續(xù)給藥90天的方法。此外，早在1990年即有研究[11]報(bào)道AD患者腦組織中鋁的含量明顯升高，其含量超過(guò)4 mg/g時(shí)即可引起神經(jīng)細(xì)胞變性，后續(xù)的研究也證實(shí)了這一點(diǎn)。有學(xué)者將兩種藥物聯(lián)合給予動(dòng)物，結(jié)果動(dòng)物相繼出現(xiàn)與AD密切相關(guān)的癥狀及病理改變，如學(xué)習(xí)障礙、AchE活性的增強(qiáng)、老年斑的沉積等，故本研究中采用D-gal聯(lián)合AlCl3同時(shí)給予大鼠，結(jié)果表明，大鼠連續(xù)給予兩種藥物90天后，出現(xiàn)明顯的學(xué)習(xí)記憶能力下降，其海馬組織中Aβ蛋白表達(dá)增加。研究[12]發(fā)現(xiàn)，不斷增多的Aβ蛋白可刺激正常腦組織產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，釋放IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥因子，造成腦內(nèi)炎癥微環(huán)境。除此之外，研究[13]發(fā)現(xiàn)過(guò)度沉積的Aβ蛋白能夠激活A(yù)chE的表達(dá)。AchE是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach)的水解酶，直接參與大腦的思維和學(xué)習(xí)記憶等功能，當(dāng)AchE活力升高時(shí)，能夠?qū)е翧ch被大量破壞，從而降低學(xué)習(xí)記憶能力。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，說(shuō)明D-gal聯(lián)合AlCl3可成功建立大鼠AD模型。本研究結(jié)果顯示，給予腹腔注射低高劑量的PPF治療的AD大鼠不僅能夠縮短平均逃避潛伏期，還可延長(zhǎng)其60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)；此外，PPF還能顯著抑制Aβ蛋白沉積，并且抑制由Aβ蛋白沉積所致的AchE過(guò)度活化；與低劑量PPF組相比，高劑量的PPF對(duì)AD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改善效果更佳，且抑制Aβ蛋白的過(guò)度沉積，減弱AchE的活力。不僅如此，我們采用了多奈哌齊作為陽(yáng)性對(duì)照藥來(lái)評(píng)價(jià)PPF的藥效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量PPF與多奈哌齊的治療效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異。

在本研究中，我們還測(cè)定了海馬組織中的炎癥生物標(biāo)志物IL-1β、IL-6、TNF-α、p-NF-κB的表達(dá)。眾所周知，腦內(nèi)炎癥的發(fā)展也是AD等神經(jīng)退行性疾病的一個(gè)顯著病理特征。腦內(nèi)炎癥主要由于星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。Aβ蛋白過(guò)度沉積會(huì)刺激細(xì)胞產(chǎn)生并釋放多種促炎細(xì)胞因子，導(dǎo)致神經(jīng)元受到損傷[14]。p-NF-κB蛋白本身在Aβ蛋白誘導(dǎo)的促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放中起著關(guān)鍵作用，p-NF-κB發(fā)生核轉(zhuǎn)移可引起炎癥反應(yīng)，包括微循環(huán)改變和炎性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞)聚集。當(dāng)巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子，包括急性細(xì)胞因子(IL-1、IL-6和TNF-α)和慢性細(xì)胞因子(轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β)時(shí)，炎癥反應(yīng)開(kāi)始，這些細(xì)胞因子刺激內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等基質(zhì)細(xì)胞釋放的炎癥介質(zhì)，引起局部微血管擴(kuò)張和毛細(xì)血管通透性增加，這反過(guò)來(lái)又通過(guò)釋放趨化因子和表達(dá)細(xì)胞粘附分子促進(jìn)炎癥區(qū)域的白細(xì)胞聚集。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的海馬組織內(nèi)IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，NF-κB信號(hào)通路被激活產(chǎn)生p-NF-κB，導(dǎo)致p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著升高；而低高劑量的PPF可降低IL-1β、IL-6、TNF-α水平，減輕p-NF-κB蛋白的相對(duì)表達(dá)量達(dá)到抑制炎癥的作用。在此基礎(chǔ)上，我們也比較了低高劑量PPF和陽(yáng)性藥物多奈哌齊的抑制炎癥反應(yīng)的效果，結(jié)果表明，與低劑量PPF組相比，高劑量的PPF和多奈哌齊對(duì)AD可抑制p-NF-κB蛋白相對(duì)表達(dá)量，降低IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌；而高劑量PPF與多奈哌齊的抑制炎癥反應(yīng)的效果相當(dāng)，無(wú)顯著性差異。

綜上所述，高劑量PPF腹腔注射可顯著改善AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其機(jī)制可能與抑制海馬組織中Aβ蛋白沉積、增強(qiáng)膽堿能功能、抑制NF-κB蛋白磷酸化、減輕腦內(nèi)炎癥反應(yīng)有關(guān)。其具體作用的分子機(jī)制尚未十分明確，需要進(jìn)一步探討研究。